肝素-超氧化物岐化酶結(jié)合物(HeP-SOD)防治輻射損傷作用的研究.pdf

1、隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，日益精密先進的放射療法在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而，腫瘤周圍的正常組織損傷始終是一個無法根本克服的難題，很大程度上阻礙了放療的進一步深化應(yīng)用。為了有針對性地研究出高效低毒的輻射保護劑，首先需要了解輻射損傷的產(chǎn)生機理。目前被廣泛接受的是一種氧化應(yīng)激損傷學(xué)說，該學(xué)說認為輻射作用于機體后，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧類物質(zhì)(reactiveoxygenspecies，ROS)，后者靶向損害DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生

2、物大分子進而引起相關(guān)組織功能異常，產(chǎn)生損傷效應(yīng)。其中，ROS家族包含了多個成員，超氧自由基(superoxideradical，(O-2))最先產(chǎn)生并通過后續(xù)反應(yīng)可誘發(fā)多種其它ROS。可見，清除(O-2)對緩解輻射損傷起著關(guān)鍵作用。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是體內(nèi)唯一特異性歧化(O-2)的酶，但是其直接藥用存在易降解、穩(wěn)定性差、半衰期短等不足。為提高此類酶類藥物在體內(nèi)的生物利用度，化學(xué)修飾是常用的方

3、法之一。我們在此采用功能性黏多糖肝素作為修飾劑，旨在改善蛋白質(zhì)藥物的自身不足，同時也能整合多種生物學(xué)功能，從而協(xié)同其藥效的發(fā)揮。本課題中，我們借鑒前人研究基礎(chǔ)，先后分離純化SOD原料并制備出肝素修飾SOD結(jié)合物(Hep-SOD)。通過SDS-PAGE、Native-PAGE、SEC-HPLC、連苯三酚自氧化速率測定法及凝膠滲透色譜-多角度激光散射技術(shù)檢測SOD及Hep-SOD的純度、酶比活、分子量等。運用優(yōu)化的MTT法于體外初步評價He

4、p-SOD對小鼠肺成纖維細胞L929的輻射防護作用。采用總SOD測試盒檢測小鼠外周血中酶活性和Hep-SOD的基本藥代動力學(xué)參數(shù)。參考抗輻射藥物的臨床前試驗指導(dǎo)原則，在小鼠全身水平開展Hep-SOD對輻射損傷防護作用的體內(nèi)評價。
　　 1.豬血SOD原料的分離純化
　　 借鑒前人研究基礎(chǔ)，采用DEAE-SepharoseFastFlow對豬血SOD原料進行分離純化。聯(lián)合SDS-PAGE和SEC-HPLC對SOD純化產(chǎn)品進

5、行純度的定性和定量檢測。結(jié)果表明DEAE-SepharoseFastFlow一步法可將SOD的純度由87％提高到100％左右。聯(lián)合BCA蛋白定量和微量連苯三酚自氧化速率法測定活性，純化后SOD的酶比活由3076u/mgprot提高到4614u/mgprot。
　　 2.肝素修飾SOD結(jié)合物(Hep-SOD)的制備及其純度和分子量的測定
　　 借鑒前人研究基礎(chǔ)，先后經(jīng)過肝素活化、結(jié)合反應(yīng)及Q-SepharoseFastFl

6、ow分離純化制備Hep-SOD。采用三硝基苯磺酸法（TNBS法）檢測出SOD的平均自由氨基修飾率為32％。通過SDS-PAGE和Native-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)分離純化出兩種修飾率不同的Hep-SOD，分別為Hep-SOD1和Hep-SOD2。與未修飾SOD相比，Hep-SOD1酶比活保留率為68％，Hep-SOD2的酶比活保留率為40％。借助凝膠滲透-多角度激光散射技術(shù)，測得兩者的重均分子量（(M)w）分別為49.69kDa和61.0

7、7kDa。
　　 3.Hep-SOD對小鼠L929細胞輻射防護作用的體外評價
　　 先后對L929細胞接種密度、產(chǎn)生敏感性照射劑量及照射后檢測時間進行篩選，結(jié)果表明L929按每孔2000個細胞進行接種，于照后48h進行MTT檢測，可對4Gy的X射線產(chǎn)生顯著的輻射敏感性。同時，Hep-SOD用藥劑量的篩選結(jié)果顯示:可能源于較高的肝素修飾率，Hep-SOD2的安全劑量范圍較窄，僅在500～0μg/ml（即112.5～0U/m

8、l）范圍無細胞毒作用;而Hep-SOD1在考察的劑量范圍1000～0μg/ml（即990～0U/ml）內(nèi)均無細胞毒作用。為方便比較，我們統(tǒng)一考察112.5U/ml的Hep-SOD1和Hep-SOD2分別在照前給藥和照后給藥對L929細胞的輻射防護作用。結(jié)果表明:二者照前給藥的防護作用突出，相對細胞活力與正常對照組相比無顯著差異;而照后給藥則無此作用。
　　 4.Hep-SOD在小鼠體內(nèi)基本藥代動力學(xué)參數(shù)的測定
　　 對小

9、鼠采用腹腔注射，于給藥后不同時間點采血，利用總SOD測試盒檢測小鼠外周血中酶活性，并結(jié)合相關(guān)軟件分析。結(jié)果表明:Hep-SOD在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)行為符合二室模型;Hep-SOD1和Hep-SOD2較未修飾SOD體內(nèi)半衰期均顯著延長，尤其是Hep-SOD2的平均滯留時間(MRT）由SOD的(10.82±0.98)h顯著延長到了(22.86±3.37)h，表現(xiàn)出更高的生物利用度。
　　 5.Hep-SOD對小鼠輻射防護作用的體內(nèi)評價<

10、br>　　 基于Hep-SOD體外評價和基本藥代動力學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果，在此著重選擇具備一定輻射防護效果和較高生物利用度的Hep-SOD2（為簡便起見，下文更換名稱為Hep-SOD）進行本章的體內(nèi)藥效評價。具體參考抗輻射藥物的臨床前試驗指導(dǎo)原則，系統(tǒng)考察Hep-SOD在受照小鼠全身水平的輻射防護作用。結(jié)果顯示:Hep-SOD可有效緩解輻射誘發(fā)的骨髓抑制;預(yù)防組織器官（尤其是肺組織）的氧化應(yīng)激損傷;阻止輻射導(dǎo)致的外周血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)

11、和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的異常升高;減輕小鼠肝組織、肺組織及小腸組織的結(jié)構(gòu)病變;整體表現(xiàn)較好的輻射損傷防護作用。但胸腺DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示照前給藥有加劇DNA損傷的可能。綜上可知，我們對輻射損傷的產(chǎn)生和Hep-SOD防護作用機理的認識還有待進一步加深。
　　 本研究取得結(jié)果和結(jié)論:
　　 (1)運用凝膠滲透-多角度激光散射光譜技術(shù)測得Hep-SOD重均分子量。
　　 (2)Hep-SOD于照射前給藥對小鼠肺

12、成纖維細胞L929可表現(xiàn)較好的輻射損傷防護作用。
　　 (3)SOD經(jīng)肝素化修飾后體內(nèi)保留時間顯著延長，生物利用度明顯提高;且隨其自由氨基修飾率的提高，Hep-SOD表現(xiàn)更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)。
　　 (4)在小鼠輻射損傷模型試驗中，Hep-SOD可有效減輕輻射誘發(fā)的骨髓抑制，緩解肝組織和肺組織的氧化應(yīng)激損傷，且抑制肝、肺和小腸的病理形態(tài)變化。但是，結(jié)果同樣顯示Hep-SOD照射前給藥可能加劇DNA損傷，這為我們?nèi)嫜芯枯?/p>