氧化低密度脂蛋白影響細胞信號通路ERK和PI3K-AKT的研究.pdf

1、背景:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是嚴重影響人類的健康的主要疾病,其機理的研究已進行了數(shù)十年。目前多數(shù)學(xué)者支持動脈粥樣硬化的損傷-反應(yīng)學(xué)說,認為內(nèi)皮細胞的損傷是發(fā)生動脈粥樣硬化的始動因素,而粥樣斑塊的形成是動脈對內(nèi)膜損傷反應(yīng)的結(jié)果。導(dǎo)致本病的各種危險因素可激活一些信號通道蛋白和炎癥因子最終損傷動脈內(nèi)膜,其中就包括了修飾的脂蛋白和高血壓的影響。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipopr

2、otein,ox-LDL)通過多種生物學(xué)作用參與了動脈粥樣硬化的發(fā)展,如趨化作用、細胞增殖或細胞毒性。而高血壓的影響主要體現(xiàn)在腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin anginotensin system,RAS)的作用,血管緊張素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)為該系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)。近年來,還發(fā)現(xiàn)了RAS的一些重要新成員:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)2、Ang-(1-7)、Ang-(1-7)受體Mas、腎素及其前體受體等。本實驗組前期試

3、驗證明腎素(前體)受體((P)RR)也存在于人臍靜脈內(nèi)皮細胞中,該受體與腎素(前體)結(jié)合后,可以通過不依賴于傳統(tǒng)的AngⅡ途徑,激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,上調(diào)某些基因的表達。
　　 已經(jīng)有研究表明,ox-LDL與血管緊張素Ⅱ有協(xié)同促動脈粥樣硬化作用,ox-LDL能夠上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因表達,AngⅡ生成增多,使ox-LDL結(jié)合更多的AngⅡ,但ox-LDL是通過AngⅡ途徑,還是通過其他途徑,如腎素(前體)受體系統(tǒng)、Ang-(

4、1-7)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,上調(diào)基因的表達還不清楚。
　　 目的:
　　 在離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelian cells,HUVECs),觀察ox-LDL對PI3K/AKT和ERK1/2信號通路蛋白的表達,以及在阻斷AT1和AT2后,觀察ox-LDL是否通過的AngⅡ途徑影響PI3K/AKT和ERK1/2信號通路蛋白表達的變化,從而探討ox-LDL

5、對致動脈粥樣硬化的機制。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)原代HUVECs。
　　 2.以ox-LDL刺激HUVECs不同的時間,觀察在不同時間下ox-LDL對ERK和P13K/AKT通路的影響;不同濃度的ox-LDL對ERK通路的影響。
　　 3.以奧美沙坦(10-5M)和PD123319(10-4分別阻斷HUVECS血管緊張素Ⅱ受體AT2、AT1,觀察ox-LDL對ERK、PERK、AKT、PAKT的

6、影響。
　　 4.予wortmannin(0.5×10-6M)阻斷PI3K/AKT信號通路,觀察wortrnannin對ox-LDL引起的AKT激活的影響。
　　 5.PD98059阻斷ERK通路觀察其對ox-LDL引起的ERK路的影響。
　　 6.ERK、PERK、AKT、PAKT均通過western-blot方法檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.ox-LDL不同時間刺激HUVECs,ERK和AK

7、T蛋白表達量沒有明顯變化,而磷酸化的ERK和AKT則在15min時蛋白表達量量最大;磷酸化的ERK在100ug/mlox-LDL作用下表達量最大。
　　 2.在阻斷AT1、AT2和ERK通路的情況下,ERK蛋白表達量無明顯變化;而磷酸化的ERK蛋白表達量明顯下調(diào)。
　　 3.在阻斷AT1、AT2和PI3K/AKT信號通路的情況下,磷酸化的AKT蛋白表達量也明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.ox-LDL可