活性氧在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用和睪酮的干預(yù)研究.pdf

1、背景和目的： 隨著年齡的增長(zhǎng)，血管壁的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生重大變化，包括血管腔擴(kuò)大，血管內(nèi)膜和中層增厚，血管僵硬度增加，部分血管壁細(xì)胞衰老，還有代表血管內(nèi)皮功能的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能減弱，這些變化改變了各種心腦血管疾病的病理生理機(jī)制，從而改變了疾病發(fā)生的閾值、嚴(yán)重程度和預(yù)后，可能是多種增齡相關(guān)性疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成的共同機(jī)制之一。 血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管腔內(nèi)壁，維持著血管內(nèi)皮的完

2、整及其功能的正常。血管內(nèi)皮不僅具有屏障功能，維持血流的通暢，還具有重要的內(nèi)分泌功能，它可以通過(guò)膜受體感知血流動(dòng)力學(xué)和血源性信號(hào)的變化，合成并分泌多種生物活性物質(zhì)，對(duì)維護(hù)血管結(jié)構(gòu)和功能的正常和凝血系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要的作用。血管內(nèi)皮功能障礙與諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，目前認(rèn)為它是AS形成初始階段的重要改變。近年來(lái)的研究表明，體外培養(yǎng)的衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生形態(tài)與功能的改變，表現(xiàn)為細(xì)胞肥大扁平，內(nèi)源性一氧化氮分泌減少，呈現(xiàn)出促炎與促栓的

3、表型，這或許在增齡相關(guān)的血栓栓塞性疾病中起著重要作用。 氧化應(yīng)激是經(jīng)典的衰老機(jī)制學(xué)說(shuō)之一。以往研究認(rèn)為，活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)通過(guò)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，DNA修復(fù)失代償，引發(fā)一系列基因與蛋白的表達(dá)異常，細(xì)胞發(fā)生衰老。在AS發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，ROS誘導(dǎo)一些炎癥因子基因的表達(dá)獨(dú)自或聯(lián)合參與了AS的形成過(guò)程。隨著年齡的增長(zhǎng)，這些因素在血管壁所造成的損傷不斷積累，很可能成為誘導(dǎo)血管衰老發(fā)生

4、與發(fā)展的最重要因素之一，從而使老年人更容易發(fā)生AS。 在增齡過(guò)程中，除了血管衰老本身因素之外，老年人易發(fā)AS的另一個(gè)具有老年人群特點(diǎn)的危險(xiǎn)因素是體內(nèi)隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的性激素平衡的改變。在增齡過(guò)程中，體內(nèi)性激素發(fā)生相應(yīng)變化，其中性激素水平在更年期后發(fā)生的變化顯示出性激素對(duì)機(jī)體作用的重要性。流行病學(xué)研究表明，男性40歲或50歲后，體內(nèi)睪酮水平明顯降低，而且，男性內(nèi)源性睪酮水平與多種老年性疾病密切相關(guān)。男性內(nèi)源性睪酮水平與男性血管結(jié)構(gòu)

5、隨年齡增長(zhǎng)發(fā)生的變化之間有無(wú)一定的聯(lián)系呢?目前研究還較少。睪酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響，目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道，其作用機(jī)制也還沒(méi)有明確。 因此，我們使用低濃度過(guò)氧化氫(hydrogenperoxide，H2O2)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)衰老，通過(guò)觀察測(cè)定HUVECs在ROS的作用下各種衰老指標(biāo)(細(xì)胞增殖能力、β-半乳糖苷酶的表達(dá))、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平以

6、及細(xì)胞周期調(diào)控因子(去磷酸化Rb蛋白)的表達(dá)變化，探討HUVECs衰老的機(jī)制，并予睪酮及性激素受體拮抗劑干預(yù)，探討不同濃度睪酮對(duì)活性氧誘導(dǎo)HUVECs早衰的干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制，為明確睪酮在干預(yù)血管老化中的作用，及其作用機(jī)制提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，或許能為增齡相關(guān)脈管系統(tǒng)疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1、培養(yǎng)HUVECs，采用第4～6代細(xì)胞。使用60pmol/LH2O2作用72h，誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生衰老。

7、 2、分組：①正常對(duì)照組：給予低血清(2％)培養(yǎng)基；②H2O2對(duì)照組：給予低血清培養(yǎng)基+H2O2(60pmol/L)：③睪酮干預(yù)組：分別給予睪酮3nmol/L，30nmol/L，300nmol/L，3μmol/L培養(yǎng)30min后，再加予H2O2(60μmol/L)；④機(jī)制研究組：分別給予ICI182，780、氟他胺1μmol/L培養(yǎng)30min后，給予睪酮(30nmol/L)，30min后再給予H2O2(60μmol/L)。或先給予抗

8、氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)1μmol/L，培養(yǎng)30min后，再給予H2O2(60μmol/L)。 3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞染色法檢測(cè)各組細(xì)胞的衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβgalactosidase，SA-β-gal)表達(dá)情況。2，7-二氯熒光黃(2，7-dichlorofluorescein，DCF)熒光顯色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水

9、平。WesternBlot法檢測(cè)去磷酸化Rb蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果： 1、不同濃度睪酮及生理濃度睪酮合用性激素受體拮抗劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs增殖率的影響：與正常對(duì)照組比較，H2O2對(duì)照組的HUVECs增殖率下降，差異具有顯著性(P=0.000)。LSD組間多重比較結(jié)果提示，與H2O2對(duì)照組比較，30nmol/L(生理濃度)睪酮干預(yù)組與300nmol/L、3nmol/L(稍高于或低于生理濃度)睪酮干預(yù)組的HUVECs

10、的增殖率都具有升高的趨勢(shì)(P=0.058，P=0.127，P=0.335)；3μmol/L(高于生理濃度)睪酮干預(yù)組卻具有相反的作用(P=0.000)。與30nmol/L睪酮干預(yù)組比較，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780孵育，可以降低HUVECs的增殖率，差異具有顯著性(P=0.000)；而先給予雄激素受體拮抗劑氟他胺，卻可以升高HUVECs的增殖率，差異也具有顯著性(p=0.000)。 2、不同濃度睪酮及生理濃度睪酮合

11、用性激素受體拮抗劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的SA-B-gal陽(yáng)性細(xì)胞百分率的影響：與正常對(duì)照組比較，H2O2對(duì)照組的HUVECs的SA-β-gal.染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率升高，差異具有顯著性(P=0.000)。LSO組間多重比較結(jié)果提示，與H2O2對(duì)照組比較，30nmol/L(生理濃度)睪酮干預(yù)組與300nmol/L、3nmol/L(稍高于或低于生理濃度)睪酮干預(yù)組的陽(yáng)性細(xì)胞百分率都有降低的趨勢(shì)，P分別為0.094、0.115、0.46

12、4。與30nmol/L睪酮干預(yù)組比較，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預(yù)處理，陽(yáng)性細(xì)胞百分率升高，差異具有顯著性(P=0.000)：而先給予雄激素受體拮抗劑氟他胺預(yù)處理，卻可以降低陽(yáng)性細(xì)胞百分率，差異也具有顯著性(P=0.038)。 3、抗氧化劑、生理濃度睪酮及其合用性激素受體拮抗劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS水平的影響：與正常對(duì)照組比較，H2O2對(duì)照組的HUVECs的相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度增加，差異具有顯著性(P

13、=0.000)。LSD組間多重比較結(jié)果提示，與H2O2對(duì)照組比較，抗氧化劑NAC干預(yù)組的HUVECs的相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度減弱，差異具有顯著性(P=0.000),30nmol/L睪酮干預(yù)組的HUVECs的相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度也呈減弱趨勢(shì)，P=0.362。與30nmol/L睪酮干預(yù)組比較，予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預(yù)處理，可以增強(qiáng)HUVECs的相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度，差異具有顯著性(P=0.002),而先予雄激素受體拮抗劑氟他胺預(yù)處理

14、，可以減弱HUVECs的相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度，差異也具有顯著性(P=0.004)。 4、抗氧化劑、生理濃度睪酮及其合用性激素受體拮抗劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達(dá)的影響：與正常對(duì)照組比較，H2O2對(duì)照組的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量增加，差異具有顯著性(P=0.000)。LSD組間多重比較結(jié)果提示，與H2O2對(duì)照組比較，NAC干預(yù)組的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量減少，差異具有顯著性(P=0.0

15、00)；30nmol/L睪酮干預(yù)組的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量減少，P=0.132。與30nmol/L睪酮干預(yù)組比較，予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預(yù)處理，細(xì)胞的去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量增多，差異具有顯著性(P=0.000)；而予雄激素受體拮抗劑氟他胺預(yù)處理，細(xì)胞的去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量表達(dá)量減少，差異也具有顯著性(P=0.000)。 結(jié)論： 通過(guò)本研究，我們能夠得出以下結(jié)論： 1、60μmol/

16、L的H2O2持續(xù)作用72h后，HUVECs細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加，去磷酸化Rb蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞增殖能力減弱，SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率增加，細(xì)胞發(fā)生了衰老。提示ROS引起的氧化應(yīng)激是HUVECs衰老的重要機(jī)制之一。 2、30nmol/L(生理濃度)睪酮與300nmol/L、3nmol/L(稍高于或低于生理濃度)睪酮都具有升高H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的增殖率、降低SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率的趨勢(shì)。3μmol/L(

17、高于生理濃度)睪酮卻具有相反的作用。提示睪酮對(duì)HUVECs衰老的干預(yù)作用與其濃度相關(guān)。 3、與30nmol/L睪酮干預(yù)組比較，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780孵育，可以拮抗30nmol/L睪酮的干預(yù)作用，增加HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS水平和去磷酸化Rb蛋白表達(dá)，降低H2O2誘導(dǎo)的HLJVECs的增殖率，升高SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率；而先給予雄激素受體拮抗劑，卻具有相反的作用。提示生理濃度的睪酮或許能通過(guò)部分芳香