小鼠Sca-1+心臟干細(xì)胞的分離、鑒定及體外分化潛能的研究.pdf

1、研究目的:成體心臟干細(xì)胞(CSCs)或心肌前體細(xì)胞(CMPCs)的發(fā)現(xiàn)，為心臟組織再生或修復(fù)治療注入了新的推動(dòng)力。然而，由于成體心臟組織中CSCs/CMPCs的稀缺，以及沒(méi)有特異的表面標(biāo)志，使其體外分離提取尤顯不易。更重要的是，臨床可獲取的心臟組織量少，從中可提取的干細(xì)胞將更為稀少，顯然無(wú)法滿(mǎn)足心臟組織再生的實(shí)際所需。所以，如何有效分離提取成體CSCs/CMPCs及其能否有效的體外擴(kuò)增并保留穩(wěn)定的干細(xì)胞性能成為我們研究的重點(diǎn)。
　

2、　研究?jī)?nèi)容和方法:首先，我們嘗試?yán)脝慰寺∨囵B(yǎng)法或免疫磁珠細(xì)胞分選(MACS)結(jié)合抗小鼠Sca-1的磁珠抗體來(lái)分離或分選成體小鼠CSCs/CMPCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，對(duì)其表面抗原、基因表達(dá)等表型進(jìn)行鑒定。然后鑒定其體外分化潛能，用不同的誘導(dǎo)體系來(lái)促使其向心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞分化。最后，在體外長(zhǎng)期傳代擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，對(duì)早（P7代）、中（P28代）、晚（P53代）三代CSCs/CMPCs的干細(xì)胞表型和分化能力進(jìn)行了對(duì)比分析，從而觀察

3、長(zhǎng)期傳代是否對(duì)CSCs/CMPCs有影響。
　　研究結(jié)果:我們經(jīng)單克隆培養(yǎng)沒(méi)有得到克隆細(xì)胞，但經(jīng)MACS結(jié)合抗小鼠Sca-1磁珠抗體成功地分選到Sca-1+細(xì)胞，而且純度較高。這些Sca-1+細(xì)胞能在體外貼壁生長(zhǎng)、增殖，以形體小、類(lèi)圓及較強(qiáng)折光性為特征。經(jīng)我們分選得到的Sca-1+細(xì)胞基本不表達(dá)CD31抗原，屬于CD31-/Sca-1+亞型。其表型不同于造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞，也不具成熟心肌細(xì)胞特征，但表達(dá)有多能干細(xì)胞和心臟前體細(xì)

4、胞的特征基因。體外誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，5-氮雜胞苷沒(méi)能誘導(dǎo)出心肌特異蛋白的表達(dá)，但BMP-2/FGF-4的聯(lián)合作用使Sca-1+細(xì)胞能明顯表達(dá)心肌特異的基因或蛋白，但還不能形成具有自律性和收縮能力的成熟心肌細(xì)胞。在TGF-β1的誘導(dǎo)下，Sca-1+細(xì)胞能上調(diào)平滑肌特征基因或蛋白的表達(dá)。此外，在VEGF165的作用下，Sca-1+干細(xì)胞能夠明顯表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特征基因或蛋白。這些成體心臟來(lái)源的Sca-1+細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，多達(dá)50代以上，并保持

5、著較為穩(wěn)定的干細(xì)胞表型和多向分化潛能，而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)致瘤性。
　　結(jié)論:經(jīng)鑒定，我們確定獲得的Sca-1+細(xì)胞為成體小鼠CSCs，屬于CD31-/Sca-1+亞群，可以在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代，具有成心肌、平滑肌及內(nèi)皮樣細(xì)胞的多向分化潛能。MACS良好的分選效率為我們將來(lái)從人體心臟組織中提取自體CSCs提供寶貴的經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)長(zhǎng)期傳代擴(kuò)增獲得的大量Sca-1+ CSCs，為心臟組織工程的研究提供了充足的種子細(xì)胞，為我們研究心臟細(xì)胞的分化發(fā)育機(jī)