奶牛乳腺干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定研究.pdf

1、目的:
　　 體外分離培養(yǎng)奶牛MaSCs，研究其生物學(xué)特性，并對其進(jìn)行體外擴(kuò)增和鑒定，開辟奶牛乳腺疾病治療的新途徑，為乳腺生物反應(yīng)器的制備提供種子細(xì)胞。
　　 方法:
　　 本試驗(yàn)分為三個部分:試驗(yàn)一分離MaSCs，并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)純化，繪制其生長曲線和瑞氏-吉姆薩(RS-GMS)染色來研究其生物學(xué)習(xí)性，并對細(xì)胞進(jìn)行凍存和復(fù)蘇。試驗(yàn)二取6月齡和18月齡奶牛乳腺組織分離培養(yǎng)MaSCs，比較其生長特點(diǎn)及增殖能力。

2、試驗(yàn)三對分離培養(yǎng)并傳代純化的MaSCs通過堿性磷酸酶（AKP）染色、染色體核型分析和αs1-酪蛋白基因和k-酪蛋白基因的PCR擴(kuò)增來進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.本試驗(yàn)應(yīng)用貼壁篩選法成功分離得到奶牛MaSCs，體外培養(yǎng)到第12代，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到5000倍以上。本試驗(yàn)分離得到的奶牛MaSCs具有干細(xì)胞的典型特征:外形呈多角形、長梭形或橢圓形，細(xì)胞核質(zhì)比較大、胞漿中細(xì)胞器少、核仁明顯。奶牛MaSCs具有快速增殖能力，細(xì)

3、胞形態(tài)均一，排列有序，體外培養(yǎng)12代細(xì)胞活性仍無變化。
　　 2.6月齡組牛MaSCs增殖能力、貼壁能力、培養(yǎng)形成的細(xì)胞集落數(shù)均高于18月齡組。
　　 3.瑞氏-吉姆薩(RS-GMS)染色證明奶牛MaSCs各代之間形態(tài)較一致，絕大多數(shù)細(xì)胞為典型的成纖維樣，細(xì)胞呈漩渦狀排列，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，有少量小圓形細(xì)胞和大而扁的細(xì)胞。
　　 4.堿性磷酸酶(AKP)染色細(xì)胞呈陽性，證明所得細(xì)胞為比較原始的細(xì)胞。
　　

4、 5.奶牛MaSCs核型分析表明該細(xì)胞具有正常核型，該細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，體外培養(yǎng)條件下沒有發(fā)生惡化。
　　 6.奶牛MaSCsαs1-酪蛋白擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條長1736bp的片段，k-酪蛋白基因酪蛋白基因擴(kuò)增出一條長度為780bp的目的條帶，擴(kuò)增片段特異性良好，無雜帶出現(xiàn)，目的片段的大小與預(yù)期結(jié)果相吻合。
　　 綜上所述，本試驗(yàn)分離得到的奶牛MaSCs的確為比較原始的細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)特征、增殖能力、及鑒