人牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)鑒定和體外誘導分化的實驗性研究.pdf

1、干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的未分化細胞，按來源分為胚胎干細胞和成體干細胞。成體干細胞因具有來源廣泛、可塑性強、無排斥反應等優(yōu)勢成為近年來研究的熱點之一。目前已經在機體幾乎所有組織中發(fā)現(xiàn)了成體干細胞。這些成體干細胞的發(fā)現(xiàn)不僅為機體損傷修復機理研究提供了新的研究平臺，而且將通過干細胞移植或構建人工組織器官在人類多種疾病治療史上產生劃時代的影響。 牙周膜干細胞屬于成體干細胞，2004年由Byoung首次提出，并且證實了其在

2、一定條件下能形成牙周膜牙骨質樣復合體，這將為其組織工程化研究提供理論依據(jù)和可靠的細胞來源。目前對人牙周膜干細胞的研究尚處于起始階段，在國內還未見人牙周膜干細胞培養(yǎng)成功的報道。 本研究采用克隆化培養(yǎng)，免疫磁珠法分離純化人牙周膜細胞，并通過細胞形態(tài)學、生物學特性及免疫細胞化學法對分離純化的人牙周膜細胞進行了初步鑒定，并在此基礎上，成功的對分離出的人牙周膜干細胞進行了體外誘導分化實驗，為后期研究牙周膜牙骨質復合體的人工生物器官的構建和

3、牙周膜再生治療提供了重要的理論和依據(jù)。 目的 研究牙周膜干細胞的生物學特性，為后期研究牙周組織工程的生物器官的構建和牙周膜再生治療提供理論基礎。分離純化人牙周膜細胞，初步了解純化后人牙周膜細胞特性，通過細胞形態(tài)學、生物學特性及免疫細胞化學法對分離純化的細胞進行初步鑒定，并在此基礎上，探討其分化的細胞學機理，進一步認識其生物學特性，為后期研究牙周膜牙骨質復合體的人工生物器官的構建和牙周膜再生治療提供重要的理論依據(jù)。

4、 方法 1、分離純化人牙周膜細胞收集臨床因正畸需要拔除的年輕恒牙，刮下其牙周膜組織，運用酶消化法獲得牙周膜細胞，采用克隆化培養(yǎng)，免疫磁珠法分離純化獲得純化后的牙周膜細胞，并對其進行細胞形態(tài)學觀察、描繪細胞生長曲線。 2、純化后的人牙周膜細胞的初步鑒定運用透射電鏡、流式細胞儀，觀察和研究細胞超微結構和細胞周期特點，通過免疫細胞化學方法檢測純化后牙周膜細胞表面相對特異性蛋白的表達，對細胞進行初步鑒定。 3、人牙周膜干

5、細胞體外誘導分化的實驗研究分別對所獲得的細胞進行成骨、成神經細胞樣的誘導分化，并對其進行細胞形態(tài)學觀察，通過免疫細胞化學方法檢測誘導后細胞表面相對特異性蛋白的表達，對誘導后的細胞進行鑒定。 結果 1、分離純化人牙周膜細胞及其生物學特性：采用克隆化培養(yǎng)方法和免疫磁珠法對人牙周膜細胞進行分離純化，獲得的細胞為成纖維細胞形態(tài)；通過細胞生長曲線測定，可見篩選純化的牙周膜細胞較未篩選純化的牙周膜混合細胞生長慢，具有慢增殖周期的干細

6、胞特點。 2、純化后的人牙周膜細胞的初步鑒定：將篩選分離的牙周膜細胞通過透射電鏡和流式細胞儀分析，結果發(fā)現(xiàn)所分離的細胞具有干細胞超微結構和細胞周期特點，通過免疫細胞化學方法檢測該細胞表面相對特異性蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)表達間充質來源細胞標志、未分化的間充質細胞標志、礦化基質形成細胞標志。提示所分離的細胞是間充質來源的、未分化的、有礦化基質形成潛能的細胞。 3、人牙周膜干細胞的礦化誘導實驗：將該細胞礦化誘導14d后，細胞形態(tài)

7、明顯發(fā)生極化；15d左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見針尖大小灰白色小結節(jié)，并逐漸增大，Vonkossa染色可見染成褐紅色的礦化結節(jié)，周邊界限不清。有礦化相關蛋白ON、BSP的表達；表明細胞礦化誘導后出現(xiàn)向成骨細胞分化。 4、人牙周膜干細胞的神經誘導分化實驗：將所獲得的細胞向神經方向做定向誘導，結果誘導4h后出現(xiàn)向神經元、神經膠質細胞的形態(tài)學變化，并表達神經元、神經膠質細胞特異性蛋白NSE、GFAP的表達。提示誘導的細胞分化為神經元、神經

8、膠質樣細胞。 結論 1、克隆化培養(yǎng)和免疫磁珠分離可獲得PDLSC，具有一定的成骨/成牙骨質細胞特性。 2、實驗所獲得的細胞具有成體干細胞的超微結構、細胞周期動力學特點，是間充質來源的、未分化的、有礦化基質形成潛能的細胞。 3、PDLSC在礦化液的誘導作用下出現(xiàn)向成骨、成牙骨質細胞的分化。 4、PDLSC在一定條件下可向神經元、神經膠質樣細胞分化。 5、可嘗試將PDLSC作為種子細胞，用于牙