不同培養(yǎng)體系下小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化潛能的研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)是多能干細(xì)胞的一種，具有干細(xì)胞的兩個(gè)基本特性：自我更新能力和多向分化潛能。在哺乳動(dòng)物中，神經(jīng)干細(xì)胞存在于發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)和成年神經(jīng)系統(tǒng)的側(cè)腦室下區(qū)和海馬，在體外不僅具有自我更新能力，而且在一定的誘導(dǎo)條件卜可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 NSCs這些特性決定了它在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面具有廣闊的前景。一方面，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的研究有助于我

2、們認(rèn)識(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育、分化等基本牛命規(guī)律，闡明諸如神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)免疫性疾病等的發(fā)病機(jī)理，還可作為藥物和功能基因篩選的理想研究平臺(tái)；另一方面，研究干細(xì)胞增殖和分化機(jī)制的最終目的是應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病。人們已經(jīng)把NSCs視為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植和替代治療的理想材料，為神經(jīng)退行性疾病(如帕金森，老年性癡呆等)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如中風(fēng)，腦缺血，脊髓損傷等)的功能重建帶來了希望。但是目前已有的研究顯示，NSCs在體外擴(kuò)增的能力有限，而且隨著

3、傳代次數(shù)的增加，分化能力和增殖能力下降。因此，深入研究NSCs的增殖、分化等基本生物學(xué)特性，建立有效的體外擴(kuò)增體系，對(duì)于NSCs的應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。 自1992年Reynolds BA建立神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系(即神經(jīng)球培養(yǎng)體系)以來，該培養(yǎng)方法一直被沿用至今。神經(jīng)干細(xì)胞以細(xì)胞團(tuán)(即神經(jīng)球)的形式懸浮生長于無血清的培養(yǎng)液中。但懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有相互聚集的傾向，神經(jīng)干細(xì)胞、向特定方向分化的神經(jīng)前體細(xì)胞以及終末

4、分化的細(xì)胞共同構(gòu)成了神經(jīng)球這樣一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞群體。為了更好的了解體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育、分化等基本的生命規(guī)律，了解體外不同培養(yǎng)條什下神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的生物學(xué)規(guī)律，我們建立了貼壁培養(yǎng)(即單層培養(yǎng))和克隆培養(yǎng)體系。在貼壁培養(yǎng)條件下，神經(jīng)干細(xì)胞呈單層貼壁伸展的狀態(tài)牛長于無血清的環(huán)境中，細(xì)胞不再聚集成球，這種擴(kuò)增形式便于我們采用RNA干擾、免疫組化等技術(shù)對(duì)增殖、分化相關(guān)基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行定位、定性和定量的研究，為深入探討神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)分化等相

5、關(guān)基因的功能提供了良好的細(xì)胞模型。而克隆培養(yǎng)體系則是更為客觀的探討神經(jīng)干細(xì)胞的牛物學(xué)特性的工具，該體系對(duì)于幫助我們初步闡明神經(jīng)干／祖細(xì)胞(NSCs／NPCs)增殖、分化的機(jī)理，神經(jīng)干細(xì)胞的分裂模式，認(rèn)識(shí)神經(jīng)干細(xì)胞生長、分化及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等生命規(guī)律，獲取大量背景較純的神經(jīng)干細(xì)胞群體用于干細(xì)胞替代治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。全文包括兩個(gè)部分： 第1部分：神經(jīng)球、貼壁及克隆培養(yǎng)體系的建立 1.1.目的： 從C57／BL6小

6、鼠的胚胎(胚胎12.5天～17.5天)腦皮質(zhì)中分離NSCs；建立穩(wěn)定可靠的懸浮、貼壁和克隆培養(yǎng)體系； 1.2.方法： 1.2.1.在體視顯微鏡下從胚胎12.5天～17.5天的鼠腦中分離NSCs。 1.2.2.將所獲得的原代神經(jīng)干細(xì)胞分別采用懸浮和貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)擴(kuò)增NSCs，并觀察NSCs的生長狀態(tài)。 1.2.3.懸浮培養(yǎng)的NSCs經(jīng)過2～3次傳代培養(yǎng)后，消化NSCs為單個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板進(jìn)行克隆培養(yǎng)，

7、鏡下觀察記錄每孔情況，每7天觀察一次。 1.2.4.經(jīng)克隆培養(yǎng)獲得第一代克隆后，重復(fù)1.2.3進(jìn)一步亞克隆，以獲得第二代及第三代克隆。 1.3.結(jié)論： 1.3.1.成功地從胎鼠(胚胎第12.5天～17.5天)腦皮質(zhì)中分離出NSCs。 1.3.2.成功地采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞，并通過克隆培養(yǎng)體系獲得足量的第一、第二和第三代克隆來源細(xì)胞。 第二部分：不同培養(yǎng)體系下小鼠神

8、經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化潛能的鑒定和比較 2.1 目的： 利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR技術(shù)，對(duì)懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)三種不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞各自的增殖和分化能力進(jìn)行鑒定，以探討神經(jīng)干細(xì)胞／祖細(xì)胞生長、分化及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等生命規(guī)律和神經(jīng)干細(xì)胞的分裂特點(diǎn)，為獲取背景較純的神經(jīng)干細(xì)胞群體進(jìn)行干細(xì)胞替代治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 2.2方法： 2.2.1.在懸浮、貼壁和克隆培養(yǎng)體系下持續(xù)培養(yǎng)NSCs，以了

9、解不同培養(yǎng)條件下NSCs體外持續(xù)擴(kuò)增時(shí)間，計(jì)算NSCs／NPCs單位時(shí)間(24小時(shí))增殖倍數(shù)，計(jì)算克隆培養(yǎng)時(shí)不同細(xì)胞來源和不同代克隆的神經(jīng)球形成率，以了解不同培養(yǎng)體系下NSCs增殖潛能； 2.2.2.利用免疫細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)，檢測不同培養(yǎng)體系下NSCs向神經(jīng)元(Tuj-1)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligo)三個(gè)方向分化的潛能；提取三種培養(yǎng)體系下獲得的NSCs／NPCs的總RNA，利用RT-PCR技術(shù)檢測神經(jīng)干

10、細(xì)胞／祖細(xì)胞自我更新(nestin，GFAP等)以及向神經(jīng)元(β-IIItublin，NF-L等)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP，S100 β等)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligo1，oligo2等)三個(gè)方向分化標(biāo)志物的表達(dá)情況，并比較三種培養(yǎng)體系下NSCs的增殖和分化潛能。 2.2.3.通過分析克隆培養(yǎng)獲得的三代克隆來源細(xì)胞的增殖和分化能力，深入探討NSCs／NPCs的分裂模式。 2.3結(jié)論： 2.3.1. NSCs在三種培

11、養(yǎng)體系下都能保持一定的增殖力和三向分化能力。 2.3.2.在克隆培養(yǎng)體系中，真正的NSCs具有非常強(qiáng)大的增殖能力?？寺∨囵B(yǎng)體系較懸浮和貼壁培養(yǎng)體系在保持NSCs的增殖能力方面具有明顯的優(yōu)勢。 2.3.3. NSCs貼壁培養(yǎng)的特殊狀態(tài)有利于對(duì)NSCs進(jìn)行RNA干擾、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、免疫組化等實(shí)驗(yàn)，便于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定性、定量、定位的觀察。 2.3.4.即使在沒有促分化的條件下，NSCs的擴(kuò)增也是邊擴(kuò)增邊分化的；在bFGF的作