重組人CXCR1-CXCR2拮抗劑G31P對血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響及分子機(jī)制初探.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種與多種有生物活性的炎癥因子相關(guān)的慢性疾病，它導(dǎo)致的心腦血管疾病嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)是引起動脈粥樣硬化的主要炎癥因子之一，且IL-8沒有種屬特異性，在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。其中小鼠角質(zhì)細(xì)胞趨化因子KC(keratinocyte chemoattractant)是人IL-8的同系物。G3

2、1P是通過對人IL-8基因定點突變獲得的無活性產(chǎn)物，是人IL-8的類似物和拮抗劑，它能高效的親和其受體CXCR1/CXCR2。本實驗室已在高脂血癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)G31P能下調(diào)細(xì)胞遷移相關(guān)因子MMP2、MMP9的mRNA水平，利用劃痕實驗、Boyden Chamber實驗和激光共聚集顯微鏡觀察到G31P對A7r5細(xì)胞遷移的影響。本實驗擬通過動脈粥樣硬化模型和A7r5細(xì)胞檢測G31P對細(xì)胞遷移及相關(guān)的因子MMP2、MMP9的作用。Rho相關(guān)

3、激酶(Rho-associated kinase，ROCK)作為RhoA下游的重要效應(yīng)分子，它除了參與肌動蛋白細(xì)胞骨架形成外，還參與調(diào)節(jié)增殖、細(xì)胞黏附和遷移等細(xì)胞功能，其通路在動脈粥樣硬化的發(fā)生中具有重要的作用。而且研究證明，在PDGF引起ROCK1和ROCK2介導(dǎo)的細(xì)胞遷移中，ROCK1起主導(dǎo)作用，ROCK2無明顯變化。本實驗還探尋了G31P是否通過Rho通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的遷移作用。本研究為揭示平滑肌細(xì)胞遷移分子機(jī)制提供理論依據(jù)

4、，并為動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供一個新思路。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實驗:
　　建立動物實驗?zāi)Ｐ?(1)動脈粥樣硬化模型組(AS)，取6周齡雄性ApoE-/-小鼠10只，喂養(yǎng)高脂飼料（普通飼料、豬油、蛋黃粉、膽固醇、豬膽汁鹽）12周。期間每周皮下注射生理鹽水3次，每半月秤量一次體重，每月通過眼眶內(nèi)取血收集血清。12周AS模型建立后，在乙醚麻醉下，眼球取血并取主動脈。(2)G31P處理組(G31P)，取6周齡雄性Ap

5、oE-/-小鼠10只，喂養(yǎng)處理同模型組，期間每周皮下注射G31P(500 ug/kg)3次。(3)對照組(control)，6周齡雄性C57BL/6J小鼠8只，處理同模型組，期間普通飼料喂養(yǎng)，每周皮下注射生理鹽水3次。
　　利用HE染色觀察主動脈病理變化，以確定動脈粥樣硬化模型建立是否成功。利用ELISA法檢測動物血清中KCCIL-8)含量，同時用qRT-PCR及免疫組化方法檢測小鼠主動脈中KC(IL-8)和其受體CXCR2以及M

6、MP2、MMP9的表達(dá)。
　　2.體外實驗:
　　利用培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞系(A7r5)，通過RT-PCR方法檢測在IL-8(50ng/mL)刺激下IL-8受體(CXCR2)在不同時間(0h、1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h)的表達(dá)量。G31P(1000 ng/mL)預(yù)處理1h，IL-8(50 ng/mL)刺激A7r5細(xì)胞24h后，通過劃痕法觀察A7r5細(xì)胞的遷移，RT-PCR方法檢測A7r5細(xì)胞MM

7、P2、MMP9的表達(dá)量，通過Western blot檢測A7r5細(xì)胞ROCK1/ROCK2表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗
　　用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周后，通過病理組織學(xué)（HE染色）觀察發(fā)現(xiàn)正常組血管壁均勻結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜無脂質(zhì)條紋增生突起，中膜平滑肌細(xì)胞無增殖遷移，沒有疏松斑塊形成。動脈粥樣硬化模型組主動脈管壁結(jié)構(gòu)混亂，內(nèi)膜增生突起明顯，中膜平滑肌細(xì)胞增殖遷移出現(xiàn)的纖維斑塊，大量脂質(zhì)泡沫細(xì)胞形成的脂

8、紋脂斑。G31P處理組小鼠血管內(nèi)膜增生和脂質(zhì)條紋突起明顯改善。說明成功建立了動脈粥樣硬化模型。小鼠模型進(jìn)一步研究結(jié)果顯示:(1)與正常組相比，AS模型組小鼠體重增加明顯(P＜0.01)，而G31P處理組與AS模型組相比，小鼠體重下降顯著（P＜0.01）;(2)ELISA和qRT-PCR結(jié)果顯示，AS模型組與正常組相比血清中KC(IL-8)的含量和血管組織中的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），而在G31P處理組，KC(IL-8)的表達(dá)量明顯

9、下調(diào)(P＜0.05);(3)qRT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，AS模型組與正常組相比CXCR2及MMP2、MMP9的表達(dá)量都顯著增加(P＜0.01)，而G31P處理組，CXCR2及MMP2、MMP9在小鼠血管組織中的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。
　　2.體外實驗
　　RT-PCR實驗顯示，IL-8刺激A7r5細(xì)胞可使CXCR2表達(dá)上調(diào);劃痕實驗發(fā)現(xiàn)IL-8顯著提高了A7r5細(xì)胞遷移的速率，而G31P卻降低了遷移的速率;用G

10、31P刺激IL-8誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示IL-8增加了MMP2、MMP9的表達(dá)量(P＜0.01)，而G31P降低了MMP2、MMP9的表達(dá)量（P＜0.05）;通過G31P作用IL-8介導(dǎo)的A7r5細(xì)胞，用Western blot方法發(fā)現(xiàn)IL-8增加了ROCK1/ROCK2的表達(dá)量(P＜0.01)，而G31P降低了ROCK1/ROCK2的蛋白表達(dá)量(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)雄性Apo