Ⅰ群禽腺病毒JS株Ⅲa蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的研制.pdf

1、根據(jù)群特異性抗原的不同，禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AV)屬可分為3群：Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒包括從雞、火雞、鵝及其它禽類分離獲得的腺病毒。Ⅰ群禽腺病毒JS株的Ⅲa蛋自位子病毒衣殼的表面，由前體蛋白剪切后磷酸化而成，每個(gè)五鄰體基底與5個(gè)pⅢa單體相連。 本研究根據(jù)Genbank上公布的雞胚致死孤兒病毒(CELOV)Ⅲa蛋白核酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物。SDS-蛋白酶K法提取病毒DNA作為PCR擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增

2、到1728 bp的特異性條帶。將其克隆入pGEX-6p-1原核表達(dá)載體中。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，獲得的序列與CELOVⅢa蛋白基因進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩病毒蛋白基因同源性達(dá)到了99.7％。用已構(gòu)建好的表達(dá)FAVI-JS株Ⅲa基因的原核表達(dá)載體pGEX-Ⅲa轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后裂解菌體作SDS-PAGE，出現(xiàn)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)產(chǎn)物，并用Western-blot專進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果證明Ⅲa蛋白

3、獲得表達(dá)。 通過(guò)雜交瘤技術(shù)，將用FAV-JS株病毒雞胚尿囊液免疫的小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)10天后，將收取的上清與原核表達(dá)的Ⅲa蛋白進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，通過(guò)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，最終獲得了6株能分泌抗Ⅲa蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為FAV—Ⅲa-2E5，F(xiàn)AV-Ⅲa-384，F(xiàn)AV-Ⅲa-3F8，F(xiàn)AV-Ⅲa-3EI1，F(xiàn)AV-Ⅲa-4C3，F(xiàn)AV-Ⅲ