自動捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管化的新型皮膚替代物的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著皮膚組織工程研究的進(jìn)展，從表皮、成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與移植到真皮支架的研制與應(yīng)用技術(shù)已較為成熟，各種人工皮膚產(chǎn)品也相繼問世，尤其是各種真皮替代物成功應(yīng)用于臨床并收到了良好的修復(fù)效果。在此基礎(chǔ)上，有研究者將皮膚種子細(xì)胞復(fù)合真皮支架構(gòu)建了含表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的活性皮膚替代物，試圖一次性修復(fù)缺損的表皮層和真皮層，然而，其不僅構(gòu)建時間長，程序復(fù)雜，而且移植后血管化慢、存活率低，限制了其臨床應(yīng)用，因此尋找一種快速構(gòu)建皮

2、膚替代物并促進(jìn)其血管化的方法成為皮膚組織工程研究中亟待解決的難題。
　　 目前組織工程皮膚的制備主要基于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模式，常規(guī)方法需要首先擴(kuò)增足量的細(xì)胞后，再接種于真皮支架上進(jìn)行2-3周的培養(yǎng)才能完成構(gòu)建，其不僅耗時長，不能及時滿足臨床需要，而且長時間的培養(yǎng)容易導(dǎo)致細(xì)胞老化、增殖活性降低。三維培養(yǎng)方式及微載體培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)為解決貼壁依賴型細(xì)胞的大規(guī)模快速培養(yǎng)提供了有效方法，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。前期研究中我們將人胎盤來

3、源的羊膜制備為羊膜微粒，發(fā)現(xiàn)其不僅具備良好的組織相容性適宜作為真皮支架，而且以其作為微載體能夠快速擴(kuò)增表皮干細(xì)胞。因此，本研究擬在上述研究的基礎(chǔ)上以羊膜微粒作為真皮支架，采用三維培養(yǎng)技術(shù)提供一種快速構(gòu)建活性真皮替代物的方法。
　　 促進(jìn)皮膚替代物血管化一直是皮膚組織工程研究的熱點。目前研究者主要采用真皮支架連接血管生成相關(guān)因子或進(jìn)行體外構(gòu)建微血管樣結(jié)構(gòu)的方式，這些方法均存在一定的局限性，因為新生血管形成需多種因子、細(xì)胞外基質(zhì)及相

4、關(guān)細(xì)胞的共同參與，單一的調(diào)控因素效果并不理想。此外體外構(gòu)建內(nèi)皮化的皮膚替代物雖具有一定應(yīng)用前景，但操作難度大，技術(shù)條件要求高，難以廣泛推廣。最近研究表明，存在于外周循環(huán)血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPC)是新生血管形成的關(guān)鍵參與者，其不僅直接參與缺血組織的干細(xì)胞血管發(fā)生，而且通過分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與局部新生血管形成過程。然而，由于分離、培養(yǎng)自體EPC的方法尚未成熟，使EPC的應(yīng)用受到極大的

5、限制。最新研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(Stromal cell-derived factor-1alpha，SDF-1α)是EPC的強大趨化劑，它通過與EPC表面的特異性受體CXCR4(chemokine CXC receptor type4，CXCR4)結(jié)合，在短時間內(nèi)即可迅速動員骨髓中EPC進(jìn)入外周血，并介導(dǎo)外周血中的EPC遷移、歸巢到缺血缺氧組織局部，參與血管新生及損傷血管的再內(nèi)皮化。
　　 本研究設(shè)想，利用SDF-1

6、α對EPC的強大趨化作用，以羊膜微粒作為真皮支架，結(jié)合三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，設(shè)計一種能自動捕獲外周血中EPC并快速構(gòu)建活性真皮替代物的方法。
　　 研究方法：
　　 1.SDF-1α質(zhì)粒構(gòu)建與慢病毒包裝
　　 1.1重組質(zhì)粒構(gòu)建
　　 利用cDNA文庫，以PCR方法獲取目的基因，將目的基因SDF-1α與pGC-FU載體融合獲得重組質(zhì)粒。再將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞， Western Blot檢測轉(zhuǎn)染293T

7、的樣品。
　　 1.2 SDF-1α-LV慢病毒包裝
　　 將帶有GFP熒光且過表達(dá)SDF-1α的重組質(zhì)粒和輔助原件質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞獲得慢病毒濃縮液，利用Real Time-PCR法對不同濃度病毒感染后樣品組的CT值及表達(dá)量進(jìn)行分析，檢測病毒滴度。
　　 2.SDF-1α慢病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞
　　 2.1轉(zhuǎn)染效率評價
　　 預(yù)實驗確定適合的MOI值，SDF-1α-LV轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞獲

8、得SDF-1α過表達(dá)成纖維細(xì)胞（SDFovHDF），熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.2目的基因及蛋白表達(dá)測定
　　 Realtime-PCR檢測目的基因表達(dá)情況，ELISA檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白含量。
　　 3.EPC趨化、遷移實驗
　　 采用Transwell共培養(yǎng)小室遷移實驗及劃痕實驗，評價SDFovHDF對EPC的趨化、遷移作用的影響。<

9、br>　　 4.構(gòu)建活性真皮替代物
　　 以羊膜微粒作為真皮支架，SDFovHDF為種子細(xì)胞，利用三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系構(gòu)建含成纖維細(xì)胞的活性真皮替代物。熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察成纖維細(xì)胞粘附增殖情況。
　　 5.活性真皮替代物移植全層皮膚缺損創(chuàng)面
　　 以C57BL鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面為動物移植模型，將構(gòu)建好的含成纖維細(xì)胞的真皮替代物移植創(chuàng)面，定期檢測外周血EPC數(shù)量，測定創(chuàng)面愈合率，并行組織學(xué)檢測、血管化評價。

10、r>　　 研究結(jié)果：
　　 1.慢病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞鑒定
　　 SDF-1α過表達(dá)質(zhì)粒測序結(jié)果正確，慢病毒滴度均在2.00E+8 TU/ml，MOI值為20時可獲得理想的感染效率。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測成纖維細(xì)胞感染率均在90％以上。病毒感染后5天鏡下觀察，可見SDFov HDF組陽性信號集中于胞漿中，GFP-HDF組細(xì)胞整體均發(fā)綠色熒光。RealTime-PCR結(jié)果顯示，SDFov HDF組mRNA表達(dá)量相對

11、未感染組為5.3倍。ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清SDF-1α表達(dá)量為173±6pg/10(')6個細(xì)胞，GFP-HDF組未檢測到。
　　 2.SDFov HDF細(xì)胞對EPC的遷移、趨化效果
　　 Transwell共培養(yǎng)小室遷移實驗表明，三組細(xì)胞(SDFov HDF組、GFP-HDF組及HDF組)趨化的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量分別為為392±27個/視野，204±17個/視野(p＜0.01)，181±17個/視野(p＜0.01)

12、，表明SDFov HDF對EPC具有明顯的趨化作用。
　　 劃痕實驗表明SDFov HDF組培養(yǎng)上清可顯著增強EPC的遷移能力，在24h內(nèi)細(xì)胞遷移數(shù)量為72±8.3個，明顯高于HDF組41±5.7個(p＜0.01)及DMEM組38±6.7個(p＜0.01)。
　　 3.構(gòu)建活性真皮替代物
　　 培養(yǎng)24h觀察即可見微型真皮替代物表面成纖維細(xì)胞形態(tài)良好，呈三維立體生長，此后細(xì)胞逐漸增殖，培養(yǎng)5-7d即可見細(xì)胞布滿微

13、粒表面，部分微粒間相互粘連成團(tuán)。
　　 掃描電鏡可見細(xì)胞密集粘附于羊膜微粒表面，細(xì)胞形態(tài)飽滿呈梭形，部分微粒呈球形卷曲。
　　 4.活性真皮替代物移植促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)
　　 移植后3、5、7天測定小鼠外周血EPC顯示，SDFov HDF組EPC百分比明顯高于其他組(p＜0.01)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)SDFovHDF組血管化明顯，血管密度明顯高于其他組(p＜0.01)。Western Blot檢測3d、5d、7d、10d

14、創(chuàng)面SDF-1α含量發(fā)現(xiàn)SDFovHDF-mAM組顯著高于其他實驗組。
　　 計算創(chuàng)面愈合速度表明SDFov HDF組愈合時間為17.25±0.7天，明顯快于HDF微粒組18.5±1.2天(p＜0.01)、空白微粒組18.87±1.1天(p＜0.01)。創(chuàng)面愈合后觀察可見微粒移植組創(chuàng)面愈合平整、柔軟，收縮程度輕。組織學(xué)檢測可見微粒填充作為真皮基質(zhì)，表皮復(fù)層較厚。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、利用過表達(dá)SDF-1α