TLRs配體對細胞增殖分化的影響及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、大多數(shù)的多細胞生物在長期的進化過程中形成了一套有效的識別和清除感染病原體的免疫反應系統(tǒng)，即天然免疫(innateimmunity)和獲得性免疫(adaptiveimmunity)。病原體在漫長的進化過程中一直保留著一部分結構成分，這種保守分子結構被稱作病原體相關分子模式(pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs)。天然免疫在進化過程中產(chǎn)生了一套天然免疫識別分子，又稱模式識別受體(pattern

2、recognitionreceptors，PRRs)來辨別PAMPs并發(fā)現(xiàn)病原體的存在。ToⅡ樣受體(Tolllikereceptor，TLRs)是進化中形成的PRRs，從無脊椎動物一直保留到人類，人體Toll樣受體家族目前已被確認的成員共有11個，機體感染期間，不同的PAMPs成為“危險信號”，由特定的TLR識別后將啟動不同胞內級聯(lián)通路的活化，最終導致NF-кB的轉位與相應免疫基因的活化而轉錄，導致多種效應分子的基因表達，如炎性細胞因

3、子、趨化因子、共刺激分子、主要組織相容性復合物及多重效應分子等，從而成為生物抵御外物入侵的第一道防線。提示TLRs在誘發(fā)宿主先天性免疫防御反應和各種炎癥過程中起著重要的作用，并成為聯(lián)系后天性免疫系統(tǒng)的紐帶。 人工合成含CpG的寡核苷酸(OligonucleotidescontainingCpGmotifs，CpG-ODN)為TLR9配體，可與TLR-9結合而最終激活NFкB，誘導多種細胞因子的分泌，提高細胞共刺激分子的表達，刺激

4、B細胞分泌抗體，為激發(fā)機體固有免疫反應的重要分子。并且CpGODN刺激分泌的細胞因子以IL-12為主，可隨后誘導Th1型的免疫反應。由於含CpGmotif的ODN可激活多種免疫細胞，誘導Th1型的免疫反應，已廣泛用于抗病毒，抗細菌感染，抗腫瘤，治療過敏性疾病研究和作為免疫佐劑用于免疫治療。 免疫系統(tǒng)作為機體防衛(wèi)危險因素、維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)體系，其內部存在著錯綜復雜的相互作用對于廣泛表達在天然免疫細胞和特異性免疫細胞表面的T

5、LRs，深入研究其配體識別、信號轉導、免疫因子活化等各個環(huán)節(jié)為進一步認識免疫系統(tǒng)的結構與功能提供了新視角，并為研究疾病發(fā)生機制、宿主對疾病的易感性等問題提供了新的啟迪。隨著免疫學以及生命學科整體的飛速發(fā)展，注重進化淵源特點和環(huán)境與宿主相互作用關系與結果給免疫學研究帶來新的生機，同時也是天然免疫在沉寂多年后重新成為研究熱點的客觀背景。本實驗研究了TLRs配體對大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響效應及TLR9配體的抗腫瘤活性。 第一部分TLR

6、s配體對大鼠脊髓神經(jīng)干細胞增殖的影響 目的：炎癥與再生修復在生物進化中是彼此相連的過程。干細胞(Stemcells/progenitorcells)的存在能促使損傷組織的修復與再生，長期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervousSystem，CNS)的損傷與再生一直是困擾人類健康的難題.無法找到良好的治療方法，研究證明成體哺乳動物CNS內存在類似干細胞性質的神經(jīng)前體細胞(neuralprogenitorcellsNPCs)

7、，NPC是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內長期提供新細胞(神經(jīng)元和膠質細胞)的源泉，將成為CNS疾病治療的新手段，因此NPCs的發(fā)現(xiàn)給因疾病或外傷所致的CNS功能喪失的治療修復帶來了希望。脊髓內的神經(jīng)干細胞(neuralprogenitorcells，NPCs)可促使脊髓損傷組織的修復，然而，調節(jié)NPCs增殖與分化的機理迄今未明，我們在此研究篩選出了某些Toll樣受體(Tolllikereceptor，TLR)配體經(jīng)腹腔注射給藥后可引起脊髓NPCs增殖。

8、方法：大鼠經(jīng)單次腹腔注射TLR不同配體，增殖的細胞由BrdU跟蹤標記。增殖的NPCs由抗巢蛋白nestin與抗BrdU的雙染抗體標記，增殖的Microglia由抗ED-1與抗BrdU雙染抗體標記.結果：PSCpG-ODN未引起脊髓NPCs的明顯增殖，而PolyI：C、LPS、與R848可引起B(yǎng)rdU+細胞顯著性增加。注射PolyI：C或R848的大鼠脊髓BrdU+細胞密度于注射后2-3天達最高，隨后快速降至正常水平?？梢夿rdU+/ne

9、stin+雙陽性細胞的存在，提示有增殖的NPCs的存在，很少見ED-1+/BrdU+雙陽性細胞，提示增殖的非Microglia細胞.此外，伴隨NPCs增殖的還有CNS先天免疫系統(tǒng)的激活，如神經(jīng)小膠質細胞的活化。然而，細胞的增殖及microglia的活性被皮質類固醇藥物地塞米松幾乎完全抑制，卻未受消炎痛的影響。結論：某些TLR的配體被TLR識別后可能參與脊髓內正常神經(jīng)細胞的發(fā)生過程，提示先天性的免疫系統(tǒng)與再生修復過程之間的相互作用的復雜性

10、，PAMPs被TLR受體所識別顯示出與炎癥性及再生修復過程的緊密相關，這對開發(fā)促進組織再生修復的藥劑，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺來說是一有價值的工具。 第二部分TLR9配體CpG-ODN殼聚糖納米粒的制備及其提高抗腫瘤活性研究 目的：腫瘤的基因治療可通過導入外源寡核苷酸(oligonucleotides，ODN)，改變腫瘤細胞的基因表達，直接殺傷或減緩腫瘤細胞的生長，抑止腫瘤血管形成，激活機體對腫瘤抗原的免疫應

11、答或阻止腫瘤細胞的擴散等方式達到腫瘤治療的目的。腫瘤的基因和免疫治療一般要求治療性ODN能夠進入細胞，到達作用靶部位，并在機體內保持足夠的穩(wěn)定性。CpG-ODN可與TLR-9結合最終激活多種免疫細胞，分泌多種細胞因子，誘導Th1型的免疫反應，己廣泛用于抗病毒，抗細菌感染，抗腫瘤等疾病研究。殼聚糖作為基因載體的多功能性，有廣泛的應用前景，但是國內外目前的研究主要在體外轉染階段，對其在體內轉染的研究非常有限。本研究選用殼聚糖作包裹CpG-O

12、DN的包囊材料，制備了殼聚糖-CpG-ODN納米復合物，并將其注射轉染于動物體內驗證了其抗腫瘤的生物效應。方法：殼聚糖作包裹CpG-ODN的包囊材料，制備了殼聚糖-CpG-ODN納米復合物，將其皮下注射于罹患腫瘤的小白鼠，應用MTT法檢測了各組CTL殺傷殺傷率，采用ELISA法分析了各組抗瘤細胞因子的分泌情況，運用流式細胞技術檢測了各組腫瘤細胞的凋亡率。結果：殼聚糖-CpGODN納米粒組的各項抗瘤指標均優(yōu)于其它組。結論：顯示殼聚糖具有增

13、強CpGODN抗腫瘤的效應，TLR9及其配體CpGODN在腫瘤免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫中發(fā)揮了一定作用，為CpGODN用于腫瘤的基因和免疫治療打下了堅實的基礎。 總之，越來越多的研究表明非特異性免疫在腫瘤免疫中具有重要作用，TLRs的為我們探索先天免疫與獲得性免疫揭開了美好的前景，為各種疾病提供了新的治療思路，增強TLRs信號通路的試劑可能是抵抗病原生物或腫瘤的較好佐劑，用CpGDNA激活TLR9信號通路可能是多種疾病，尤其對腫瘤來