Leptin對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖及分化的影響.pdf

1、本文研究目的：體外分離培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞(humandentalpulpcells，HDPCs)并進(jìn)行表型鑒定及誘導(dǎo)分化，加入人工重組Leptin(recombinanthumanLeptin，rhLeptin)，檢測(cè)Leptin對(duì)HDPCs增殖、分化作用的影響。 研究方法：①收集因治療需要拔除的年輕健康恒牙，無(wú)菌條件下取出牙髓組織，分別采用組織塊法和酶消化法原代培養(yǎng)HDPCs，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底80％時(shí)傳代。②取第四代HDPCs采用M

2、TT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，免疫組織化學(xué)方法行波形絲蛋白(Vimentin)和角蛋白(cytokeratin)的免疫染色，鑒定細(xì)胞來(lái)源。③取第2代HDPCs采用間接免疫熒光法檢測(cè)血管周細(xì)胞表面抗原CD146的表達(dá)，對(duì)牙髓細(xì)胞中的未分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。分別以成脂化培養(yǎng)基和礦化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)HDPCs，鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，28天后行油紅O染色和VonKossa鈣化染色。④取第4代HDPCs采用SABC法檢測(cè)Leptin受體(Leptin-R

3、eceptor,LR)在牙髓細(xì)胞中的表達(dá)。⑤將培養(yǎng)基中加入不同濃度rhLeptin(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)培養(yǎng)HDPCs，3天后用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。第4代HDPCs以含100ng/mLrhLeptin的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組不含rhLeptin，3天后將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞技術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞各周期時(shí)相。⑥用加入不

4、同濃度rhLeptin(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HDPCs，對(duì)照組不含rhLeptin。于培養(yǎng)14天后檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephophatase，ALP)活性水平，確定rhLeptin最佳作用濃度(100ng/mL)。⑦用含100ng/mLrhLeptin的培養(yǎng)基對(duì)HDPCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，28天后觀(guān)察鈣化結(jié)節(jié)形成情況，并行VonKos

5、sa鈣化染色。采用SABC法檢測(cè)HDPCs礦化相關(guān)蛋白——牙本質(zhì)涎蛋白(dentinsialoprotein，DSP)及骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)的表達(dá)情況。 研究結(jié)果：①采用組織塊法培養(yǎng)HDPCs，牙髓組織塊接種6～10天后，可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周邊呈輻射狀游出，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，少量細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞胞體較大，核仁清晰；采用酶消化法培養(yǎng)HDPCs，消化后的細(xì)胞于第2天開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈梭形，胞體較小，部分細(xì)

6、胞形態(tài)不規(guī)則呈多角形或橢圓形，個(gè)別細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，呈集落樣生長(zhǎng)，形成細(xì)胞克隆，克隆中心細(xì)胞密集，細(xì)胞間界限不清。②MTT法測(cè)得細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示：1～3天HDPCs生長(zhǎng)相對(duì)緩慢：從第3天開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增殖期，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)升高；至第7天生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入飽和期。細(xì)胞表型鑒定結(jié)果為波形絲蛋白陽(yáng)性，角蛋白陰性。③對(duì)CD146的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：牙髓細(xì)胞內(nèi)存在少數(shù)CD146陽(yáng)性細(xì)胞，提示牙髓組織中存在牙髓干細(xì)胞(Dentalpulpste

7、mcells，DPSCs)，該細(xì)胞可表達(dá)血管周細(xì)胞抗原CD146。細(xì)胞在成脂肪化誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，可見(jiàn)部分細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)有透明脂滴形成，油紅O染色為橙紅色。礦化誘導(dǎo)4周后細(xì)胞可形成鈣化結(jié)節(jié)，VonKossa鈣化染色顯示棕黑色鈣化團(tuán)塊形成。④免疫組化表明在HDPCs細(xì)胞表面有Leptin受體表達(dá)。⑤加入不同濃度rhLeptin作用后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的

8、細(xì)胞周期時(shí)相沒(méi)有顯著變化，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x=0.38，P＞0.05)。⑥含不同濃度rhLeptin的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP活性水平明顯高于對(duì)照組(即DMEM組)，Leptin對(duì)HDPCs的ALP活性有促進(jìn)作用，并呈一定量效關(guān)系(回歸方程(^y)=0.291+0.0036x，回歸系數(shù)檢驗(yàn)t=6.49，P=0.003)，其最佳作用濃度為100ng/ml。⑦100ng/mL的rhLeptin誘導(dǎo)培養(yǎng)HDPCs4周后，VonKossa鈣化染色陽(yáng)

9、性。SABC法對(duì)牙髓細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白檢測(cè)的結(jié)果顯示：牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)及骨鈣蛋白(OCN)表達(dá)陽(yáng)性。 研究結(jié)論：①采用組織塊法及酶消化法均可在體外成功培養(yǎng)出HDPCs。②體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞內(nèi)含有一定數(shù)量的牙髓干細(xì)胞，該細(xì)胞具有未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，表達(dá)血管周細(xì)胞表面抗原CD146，并在一定條件下可以向脂肪細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。③HDPCs表面有Leptin受體表達(dá)，Leptin對(duì)HDPCs的增殖無(wú)顯著的促進(jìn)作用，但可