靶向hTERT的RNA干擾及其對腫瘤細胞增殖、凋亡影響的機制研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文靶向hTERT的RNA干擾及其對腫瘤細胞增殖、凋亡影響的機制研究姓名：王建申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：任常山20080301液滴于芯片點樣區(qū)，用蓋玻片覆蓋，置于雜交盒中，雜交過夜；使用激光共聚焦熒光掃描儀掃描芯片，用lmaGene軟件分析數(shù)據(jù)；采用Westernblot法驗證差異表達基因。第三部分，實驗分5組：空白對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組，非特異陰性對照組，S3、S4特異干擾組。轉(zhuǎn)染后48小時，流式細胞

2、儀檢測各組細胞凋亡率；轉(zhuǎn)染后48小時比色法測定各組Caspase3和Caspase8的活性；轉(zhuǎn)染后48小時，提取各組細胞胞漿蛋白，Westernblot法檢測各組細胞胞漿Cytc含量。結(jié)果第一部分，RNAiMate能有效的將siRNA轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，各特異性siRNA轉(zhuǎn)染組hTERTmRNA表達水平有不同程度的下降，以S3、S4轉(zhuǎn)染組最為顯著，而在各對照組內(nèi)hTERTmRNA水平無明顯變化；Westernblot顯示的蛋白表達變化與mRN

3、A變化趨勢相一致；MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24后，兩個特異干擾組S3、S4與陰性對照組比較，細胞增殖抑制率均顯著增高(PO05)。第二部分，芯片分析結(jié)果顯示，在干擾組與對照組之間的差異表達基因中，EGFR、VEGF、bcl2三個基因表達下調(diào)，TRAIL基因表達上調(diào)：Westernblot結(jié)果顯示，各基因的蛋白水平變化與芯片篩選結(jié)果一致。第三部分，運用流式細胞術(shù)進行細胞凋亡率分析顯示，各對照組之間的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義渺O05)，而兩個

4、干擾組與對照組比較，凋亡率均顯著增高(PO05)；轉(zhuǎn)染后48小時，各組的easpase8活性比無顯著性差異(P005)，而兩個干擾組的caspase3活性比與對照組比較差異有顯著性(PO01)，均表現(xiàn)為活性比增高；Westernblot結(jié)果顯示，兩個干擾組的胞漿Cytc蛋白含量較對照組也有顯著的增高。結(jié)論l、化學(xué)合成的靶向hTERT的siRNA能有效抑制HeLa細胞中hTERT的表達，并能抑制HeLa細胞增殖。2、靶向hTERT的siR