拓撲替康對HPB-AM細胞增殖及MAGE基因表達影響的研究.pdf

1、背景：黑色素瘤抗原(Melanoma antigen-encoding，MAGE)是第一個從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)性抗原(tumor-associated antigen，TAA)。人類MAGE基因家族編碼的腫瘤排斥抗原(tumor rejection antigen，TRA)在細胞內(nèi)經(jīng)加工產(chǎn)生抗原肽，并與HLA-I類分子結(jié)合形成復(fù)合物，能誘導(dǎo)自體細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)特異

2、性識別，誘導(dǎo)其對相應(yīng)腫瘤細胞的特異性殺傷。MAGE基因在許多惡性腫瘤中都有較高的表達，而在正常組織(除胎盤滋養(yǎng)層及睪丸精原細胞之外)、炎癥組織及良性腫瘤組織中均無表達，因而被認為是腫瘤特異性的，可用于腫瘤的分子學(xué)診斷和免疫治療。初步的臨床實驗已證實了該MAGE基因在抗腫瘤治療中的意義。 拓撲替康(Topotecan，TPT)是細胞核拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的獨特而有效的抑制劑，它通過與DNA/拓撲異構(gòu)酶Ⅰ聚合物形成穩(wěn)定的共價復(fù)合物來發(fā)揮其抗

3、腫瘤作用。近來發(fā)現(xiàn)它對多種難治性實體腫瘤尤其對部分血液系統(tǒng)腫瘤有效，單用 topotecan治療復(fù)發(fā)、難治非霍杰金淋巴瘤有效率達40％。雖然TPT在治療白血病、淋巴瘤等惡性血液病的臨床實驗中已顯示了明顯的抗腫瘤活性，但對其作用的分子機理尚不清楚。TPT對淋巴瘤細胞的作用及其與MAGE基因之間的關(guān)系有待探討。本實驗旨在研究TPT誘導(dǎo)T細胞淋巴瘤系HPB-AM細胞株凋亡的作用及TPT作用與MAGE基因之間的關(guān)系，為進一步了解TPT對腫瘤細胞

4、的作用機制，提高TPT的臨床療效提供有意義的實驗資料。 方法： 1．本研究以T細胞淋巴瘤系HPB-AM細胞株為研究對象，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法在mRNA水平檢測MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4基因的表達情況。 2．采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)檢測不同濃度(Oμ

5、mol/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)TPT作用于HPB-AM細胞株不同時間后(0、4、8、12、16小時)的增殖情況，計算各組細胞的增殖抑制率，并確定TPT抑制HPB-AM細胞增殖的最小有效濃度和最短作用時間。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。 3．采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平檢測TPT對HPB-AM細胞株MAGE基因表達的影響。 4．應(yīng)

6、用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本的T檢驗，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。重復(fù)5次獨立試驗，檢驗水準以P值<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1．HPB-AM細胞MAGE基因的表達 MAGE.3的表達水平為0.94±0.03，MAGE-4的表達水平為0.85±0.01，MAGE-1、MAGE-2均無表達。 2．TPT對HPB

7、-AM細胞株增殖的抑制作用 ①采用MTT比色法檢測結(jié)果：不同濃度(0μmol/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)TPT作用HPB-AM細胞不同時間(4、8、12、16小時)，其對HPB-AM細胞的抑制作用隨濃度的增高而逐漸增強，隨時間的延長而逐漸增強。最小有效濃度為0.10μmol/L，濃度為0.15μmol/L時抑制作用明顯，達到0.20μmol/L時抑制作用不再增加；

8、最短作用時間為8小時，12小時抑制作用明顯增強，超過16小時抑制作用不再增加。空白對照組抑制率無變化。 ②T胛作用細胞后的形態(tài)學(xué)改變：濃度0.10μmol/L的TPT作用HPB-AM細胞12h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞集落減少，細胞中顆粒增多，細胞碎片增多，而TPT作用前細胞均呈懸浮生長，細胞輪廓清楚，生長旺盛。 3．TPT對HPB-AM細胞MAGE基因表達的影響RT-PCR結(jié)果顯示： 當TPT濃度為(0μmo

9、l/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)，作用12小時時，MAGE-3基因相對表達量隨TPT濃度增加而減少，分別為0.94±0.03、0.87±0.05、0.78±0.03、0.65±0.05、0.59±0.06。在濃度為0.10μmol/L時基因表達明顯受抑(p=0.0299)。 TPT濃度為0.10μmol/L，作用0、4、8、12、16小時時MAGE-3表達分別為0.

10、94±0.03、0.86±0.04、0.77±0.03、0.65±0.05、0.59±0.03，在作用時間為8小時時基因表達明顯受抑(p=0.0140)。 當TPT濃度為(Oμmol/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)，作用12小時時，MAGE-4基因相對表達量隨TPT濃度增加而減少，分別為0.86±0.01、0.77±0.04、0.61±0.05、0.50±0.02、0

11、.45±0.03。在濃度為0.10μmol/L時基因表達明顯受抑(p=0.0011)。TPT濃度為0.10μmol/L，作用0、4、8、12、16小時時MAGE-4表達分別為0.85±0.04、0.78±0.02、0.67±0.05、0.45±0.02、0.41±0.04，在作用時間為8小時時基因表達明顯受抑(p=0.0403)。 結(jié)論： 1．HPB-AM細胞表達MAGE-3、MAGE-4基因；不表達MAGE-1、MAG