硼替佐米對K562細胞增殖、凋亡及其對XIAP表達的影響.pdf

1、目的：
　　 泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是生物體內蛋白質選擇性降解的重要途徑，可影響基因表達調控、細胞周期、氧化應激反應等多種細胞活動[1]。蛋白酶體活性的異常改變，可引起多種蛋白質降解異常，導致細胞功能紊亂，使腫瘤細胞持續(xù)生長，是腫瘤發(fā)生的標志之一。蛋白酶體抑制劑特異性地抑制蛋白酶體活性，阻止腫瘤生長、粘附及血管生成[2]，可以作為抗腫瘤治療的有效靶點。硼替佐米(Bo

2、rtezomib，商品名萬坷，Velcade)是高選擇性的，可逆性的蛋白酶體抑制劑，通過抑制多種蛋白質的降解，可以穩(wěn)定p21，p27和p53蛋白，轉錄因子(如c-myc、c-fos、c-jun)，IκB，細胞周期調節(jié)蛋白和一些Bcl-2家族成員(如Bak and Bax)[3，4]。在生理情況下NF-κB在胞質中與抑制蛋白IκB結合，硼替佐米通過抑制IκB的降解，下調NF-κB的活性，不但可以增加腫瘤細胞的凋亡[5，6，7]，還可以增加

3、腫瘤細胞對化療、放療[8]、免疫治療的敏感性[9]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X chromosome linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是內源性凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis，IAPs)中效力最強的蛋白，它主要通過BIR3結構域抑制caspase-9，BIR2結構域抑制caspase-3和-7[10]，達到抑制凋亡的作用。XIAP的表達受多條信號轉導通路的影

4、響，NF-κB，PI3K和MAPK等均可間接調節(jié)XIAP的轉錄。有資料顯示XIAP基因在多個白血病細胞株及急性白血病原代細胞中高表達[11]，這提示XIAP可能與白血病的發(fā)生、病程演變及預后等密切相關[12]。本研究觀察硼替佐米對K562細胞增殖、凋亡及XIAP基因和蛋白表達的影響，研究硼替佐米對白血病細胞的作用及其與XIAP之間的關系，為其做為新的抗白血病藥物提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.水溶性四唑鹽光吸收(

5、WST-1)法檢測細胞增殖：終濃度為5nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，100nmol/L硼替佐米分別作用于K562細胞12h、24h、36h、48h，WST-1法檢測細胞的增殖情況，計算增殖抑制率，并找出硼替佐米作用于K562細胞的最適時間及作用濃度。
　　 2.瑞氏染色觀察細胞形態(tài)：終濃度為30nmol/L硼替佐米處理K562細胞24h后，瑞氏染色觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)學變化。
　　

6、 3.流式細胞術檢測細胞凋亡：終濃度為5nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，100nmol/L硼替佐米分別作用于K562細胞24h，流式細胞儀AnnexinV FITC/PI雙標檢測細胞凋亡率。
　　 4.原位末端轉移酶標記(TUNEL)技術檢測細胞凋亡：終濃度為30nmol/L硼替佐米處理K562細胞24h后，TUNEL技術檢測細胞的凋亡情況。
　　 5.RT-PCR法檢測XIAP mR

7、NA的表達：終濃度為5nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，100nmol/L硼替佐米分別作用于K562細胞24h，RT-PCR法檢測硼替佐米對K562細胞XIAP mRNA表達的影響。
　　 6.免疫組化法檢測XIAP蛋白的表達：終濃度為30nmol/L硼替佐米作用于K562細胞24h，免疫組化法檢測硼替佐米對K562細胞XIAP蛋白表達的影響。
　　 7.統(tǒng)計分析：所得結果應用SPSS1

8、3.0統(tǒng)計學軟件處理，對計量資料，同一時間點各實驗組與對照組之間比較用兩樣本t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有顯著性。
　　 結果：
　　 1.WST-1結果顯示：終濃度為5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分別作于K562細胞24小時，細胞增殖抑制率分別為(13.64±0.15

9、)％、(28.7±0.49)％、(55.4±1.11)％、(68.1±1.12)％、(81.4±0.13)％，分別與空白對照組比較存在顯著差異(P<0.01)；硼替佐米組間兩兩比較，具有顯著性差異(P<0.05)，其24小時IC50為24.6 nmol/L。30nmol/L硼替佐米分別作用于K562細胞12小時、24小時、36小時、48小時，細胞增殖抑制率為(29.1±0.92)％、(55.4±1.11)％、(57.84±0.84)％、

10、(59.8±1.18)％，分別與空白對照組相比，有顯著性差異(P<0.05)；組間兩兩比較，硼替佐米12h與24h對K562細胞的抑制率有顯著性差異(P>0.05)，但24h與36h、48h的抑制率無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.細胞形態(tài)、TUNEL及流式細胞術結果顯示：終濃度為30nmol/L硼替佐米處理K562細胞24h，瑞氏染色，光學顯微鏡下示硼替佐米組細胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變，表現(xiàn)為染色質濃縮，核固縮、核邊集、核

11、碎裂，胞質中見大量空泡及凋亡小體形成；正常對照組細胞形態(tài)正常。TUNEL法計數(shù)300個細胞中陽性細胞數(shù)為147，陽性率為49.0％，與空白對照組(陽性細胞數(shù)7，陽性率2.3％)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。濃度為5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分別作于K562細胞24小時，AnnexinVFITC/PI雙標結果顯示凋亡率分別為：(15.36±0.7)％，(32.2

12、1±1.2)％，(53.87±1.3)％，(77.854±1.0)％，(81.25±2.8)％。均高于對照組(0.32±0.6％)，P<0.01。進一步行組間兩兩比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR和免疫組化結果顯示：濃度為5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分別作于K562細胞24小時后，RT-PCR擴增結果顯示，XIAP mRNA灰度比

13、值分別為0.89±0.029，0.79±0.022，0.59±0.031，0.34±0.037，0.24±0.042，與空白對照組(0.96±0.020)相比有顯著差異，p<0.01；不同濃度硼替佐米之間XIAPmRNA灰度比值相比有顯著差異，p<0.05。終濃度為30nmol/L硼替佐米處理細胞24h后，經免疫組化法染色法檢測結果顯示：K562細胞中XIAP蛋白陽性表達率在硼替佐米組為(13.33±2.71)％，與空白組(55.90±

14、1.65)％相比顯著降低(P<0.01)。硼替佐米組XIAP蛋白表達陽性平均積分為42.00±8.54，較空白組248.33±20.74有顯著性差異(P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.硼替佐米能有效抑制K562細胞的增殖，其抑制作用具有時間和濃度依賴性。
　　 2.硼替佐米能明顯誘導K562細胞凋亡，隨時間增加凋亡率增加。
　　 3.硼替佐米能明顯下調K562細胞XIAP mRNA及XIAP蛋白的