肝細(xì)胞癌MAGE-A9基因的克隆、表達(dá)及特性鑒定.pdf

1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文肝細(xì)胞癌MAGEA9基因的克隆、表達(dá)及特性鑒定姓名：徐璐申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)指導(dǎo)教師：馮振卿20050420南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文MAGE—A9基因，經(jīng)T—A連接克隆_@pMDl8一T載體，測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的MAGEA9cDNA序列比對。2限制性酶切圖譜鑒定pMDl8一T—MAGEA9克隆載體。采用質(zhì)粒抽提、純化、酶切、連接、感受態(tài)細(xì)菌制備和轉(zhuǎn)化等技術(shù)，構(gòu)建并鑒定原核表達(dá)載體。藥物誘

2、導(dǎo)MAGEA9蛋白表達(dá)，SDS—PAGE7tWesternblot初步鑒定表達(dá)結(jié)果，然后將細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)物超聲裂解，再用HiTrap親和柱純化超聲裂解上清。3MAGEA9蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB／c小鼠。取對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤SP2／O細(xì)胞與免疫小鼠的脾細(xì)胞按常規(guī)PEG方法融合，有限稀釋法克隆細(xì)胞。ELISA法檢測雜交瘤培養(yǎng)上清與MAGEA9蛋白的效價，Dotblot檢驗細(xì)胞培養(yǎng)上清與MAGE—A9的結(jié)合活性。4免疫組4tABC法檢壩JM

3、AGEA9基因在Hcc組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位。研究結(jié)果1擴(kuò)增出約945bp的MAGE—A9基因，測序證實其序列與GenBank數(shù)據(jù)庫報道序列完全一致。2限制酶切結(jié)果顯示克隆載體pMDl8T—MAGEA9構(gòu)建成功。原核分泌型表達(dá)系統(tǒng)pBAD／gIII州AGE—A9在大腸桿菌Topl0中被誘導(dǎo)表達(dá)，獲得有多聚組氨酸(His)。標(biāo)簽序列的重組表達(dá)蛋白，冷凍超聲裂菌法分離結(jié)果顯示MAGE—A9表達(dá)蛋白在菌體大部分為可溶性表達(dá)。用HiTrap柱純