丙型肝炎病毒感染者miR-181a對(duì)CD4+T細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用及信號(hào)傳導(dǎo).pdf

1、T細(xì)胞在病毒清除和持續(xù)感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，病毒感染過(guò)程中調(diào)控 T細(xì)胞的發(fā)揮免疫應(yīng)答的具體機(jī)制還不完全清楚。miRNA是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子，目前被認(rèn)為是控制生物活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。有證據(jù)表明一些 miRNA能通過(guò)直接作用于 HCV基因，或間接通過(guò)病毒相關(guān)的宿主信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié) HCV復(fù)制，并與HCV引起的肝病的發(fā)病有密切關(guān)系。本研究的目的集中在miR-181a分子，探討該分子對(duì) HCV感染者 CD4+T細(xì)胞的衰老的調(diào)控作用機(jī)

2、制。
　　方法：分離 HCV感染者或健康人外周血 CD4+T細(xì)胞，miScript miRNA array檢測(cè)HCV感染者和健康人CD4+T細(xì)胞 miRNA差異表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè) CD4+T細(xì)胞上雙特異性磷酸酶6（DUSP6）和IL-2的表達(dá)；并用純化的CD4+T細(xì)胞，轉(zhuǎn)化miR-181a precursor,流式檢測(cè) IL-2的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè) DUSP6的表達(dá)；應(yīng)用阻斷劑抑制 DUSP6表達(dá)后，

3、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD4+T上CD69、CD25和IL-2的表達(dá)，同時(shí)用 RT-PCR測(cè) DUSP6表達(dá)，然后分析它們之間的關(guān)系。
　　分離 HCV感染者或健康人外周血CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)其端粒長(zhǎng)度和衰老細(xì)胞染色；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD4+T細(xì)胞 SIRT1表達(dá)，Western Blot檢測(cè)ΔNp63在CD4+T細(xì)胞上表達(dá)；電轉(zhuǎn)染siRNA法沉默 HCV患者 CD4+T細(xì)胞中ΔNp63或SIRT1或者重構(gòu)miR-181a的表達(dá)，F(xiàn)l

4、ow-FISH法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞端粒長(zhǎng)度，PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性，染色與衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)，流式檢測(cè)增殖相關(guān)的 EdU。
　　結(jié)果表明：與健康對(duì)照者相比，HCV慢性感染者的 CD4+T細(xì)胞表達(dá)miR-181a下降，DUSP6表達(dá)過(guò)高，并且 miR-181a下降與DUSP6升高水平負(fù)相關(guān)。復(fù)原慢性HCV感染者CD4+T細(xì)胞的 miR-181a，或阻斷 DUSP6表達(dá)能恢復(fù)T細(xì)胞的免疫活性，如CD

5、25和CD69表達(dá)升高，IL-2分泌增多以及CD4+T細(xì)胞增殖能力提高。
　　進(jìn)一步研究表明：HCV誘導(dǎo)的 T細(xì)胞衰老，可被ΔNp63-miR181a-Sirt1通路對(duì)抗調(diào)節(jié)。和年齡匹配的健康對(duì)照者相比，慢性 HCV感染者 T細(xì)胞更衰老。實(shí)驗(yàn)揭示轉(zhuǎn)錄因子ΔNp63的升高能導(dǎo)致 miR-181a的下降，進(jìn)而過(guò)表達(dá)抗衰老分子 SIRT1。在HCV患者 CD4+T細(xì)胞中沉默ΔNp63或 SIRT1以及重構(gòu)miR-181a的表達(dá)能加速T細(xì)

6、胞衰老，表現(xiàn)為端粒酶活性下降，端粒長(zhǎng)度縮短，增加衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)表達(dá)，以及與增殖相關(guān)的 EdU摻入下降。意外的是，上述處理后 CD4+T細(xì)胞的 IL-2表達(dá)增加，主要是由于Foxp3+Treg（regulatory T cells）細(xì)胞百分率下降，而 Foxp3-Teff（effectors T cells）細(xì)胞百分率增加或不變。
　　這些發(fā)現(xiàn)提示HCV可能利用miR-181a信號(hào)通路調(diào)控T細(xì)胞的衰老/耗