丙型肝炎病毒感染者miR-181a對CD4+T細胞衰老的調節(jié)作用及信號傳導.pdf

1、T細胞在病毒清除和持續(xù)感染的過程中發(fā)揮重要作用。然而，病毒感染過程中調控 T細胞的發(fā)揮免疫應答的具體機制還不完全清楚。miRNA是基因轉錄后調控的重要分子，目前被認為是控制生物活動的關鍵調節(jié)器。有證據(jù)表明一些 miRNA能通過直接作用于 HCV基因，或間接通過病毒相關的宿主信號通路來調節(jié) HCV復制，并與HCV引起的肝病的發(fā)病有密切關系。本研究的目的集中在miR-181a分子，探討該分子對 HCV感染者 CD4+T細胞的衰老的調控作用機

2、制。
　　方法：分離 HCV感染者或健康人外周血 CD4+T細胞，miScript miRNA array檢測HCV感染者和健康人CD4+T細胞 miRNA差異表達；流式細胞術和實時定量 RT-PCR檢測 CD4+T細胞上雙特異性磷酸酶6（DUSP6）和IL-2的表達；并用純化的CD4+T細胞，轉化miR-181a precursor,流式檢測 IL-2的表達，RT-PCR檢測 DUSP6的表達；應用阻斷劑抑制 DUSP6表達后，

3、流式細胞術分別檢測CD4+T上CD69、CD25和IL-2的表達，同時用 RT-PCR測 DUSP6表達，然后分析它們之間的關系。
　　分離 HCV感染者或健康人外周血CD4+T細胞，檢測其端粒長度和衰老細胞染色；流式細胞術檢測 CD4+T細胞 SIRT1表達，Western Blot檢測ΔNp63在CD4+T細胞上表達；電轉染siRNA法沉默 HCV患者 CD4+T細胞中ΔNp63或SIRT1或者重構miR-181a的表達，F(xiàn)l

4、ow-FISH法檢測CD4+T細胞端粒長度，PCR-ELISA法檢測端粒酶活性，染色與衰老相關的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)，流式檢測增殖相關的 EdU。
　　結果表明：與健康對照者相比，HCV慢性感染者的 CD4+T細胞表達miR-181a下降，DUSP6表達過高，并且 miR-181a下降與DUSP6升高水平負相關。復原慢性HCV感染者CD4+T細胞的 miR-181a，或阻斷 DUSP6表達能恢復T細胞的免疫活性，如CD

5、25和CD69表達升高，IL-2分泌增多以及CD4+T細胞增殖能力提高。
　　進一步研究表明：HCV誘導的 T細胞衰老，可被ΔNp63-miR181a-Sirt1通路對抗調節(jié)。和年齡匹配的健康對照者相比，慢性 HCV感染者 T細胞更衰老。實驗揭示轉錄因子ΔNp63的升高能導致 miR-181a的下降，進而過表達抗衰老分子 SIRT1。在HCV患者 CD4+T細胞中沉默ΔNp63或 SIRT1以及重構miR-181a的表達能加速T細

6、胞衰老，表現(xiàn)為端粒酶活性下降，端粒長度縮短，增加衰老相關的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)表達，以及與增殖相關的 EdU摻入下降。意外的是，上述處理后 CD4+T細胞的 IL-2表達增加，主要是由于Foxp3+Treg（regulatory T cells）細胞百分率下降，而 Foxp3-Teff（effectors T cells）細胞百分率增加或不變。
　　這些發(fā)現(xiàn)提示HCV可能利用miR-181a信號通路調控T細胞的衰老/耗