丙型肝炎病毒感染自然轉(zhuǎn)歸分子機(jī)制研究.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染而引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病。盡管國際上在慢性丙肝防治理論與方法上取得了長足進(jìn)展,但對(duì)HCV發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制了解得并不透徹,特別是針對(duì)中國人群的HCV感染自然康復(fù)的分子機(jī)制仍不清楚。另一方面,缺乏理想的HCV感染動(dòng)物模型,特別是小型靈長類動(dòng)物感染模型,從機(jī)制與技術(shù)上阻礙了HCV疫苗免疫與抗病毒藥物研究。
　　 本課題第一部分針對(duì)中國獻(xiàn)血者人群HCV感

2、染自然康復(fù)的分子機(jī)制這一科學(xué)問題開展了研究。HCV感染可分為自然康復(fù)性感染者和慢性感染者兩個(gè)人群。HCV感染轉(zhuǎn)歸及其臨床表現(xiàn)與宿主和病毒的自然屬性以及相互作用有關(guān)。目前認(rèn)為,宿主方面發(fā)揮作用的因素可能包括免疫應(yīng)答和遺傳因素,病毒方面的因素包括遺傳異質(zhì)性、病毒載量及病毒基因型等。因此,從宿主和病毒兩方面來了解HCV自然康復(fù)和慢性感染者問的差別,對(duì)于揭示HCV自然康復(fù)及慢性感染轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)制,最終控制HCV感染具有重要指導(dǎo)意義。
　　

3、 在這部分內(nèi)容中,我們對(duì)來源于我國廣東和北京地區(qū)獻(xiàn)血者中的HCV感染者進(jìn)行研究,測定HCV感染的自然康復(fù)比率與基因型分布,探索HCV自然康復(fù)及慢性感染的分子機(jī)制。對(duì)廣東和北京獻(xiàn)血者中HCV抗體初篩陽性的血清樣品采用兩種EIA方法進(jìn)行抗體再測定,以定量PCR方法測定病毒載量,并采用巢式PCR對(duì)核酸進(jìn)行確認(rèn),進(jìn)而將樣本分為三種HCV感染狀態(tài),即自然康復(fù)性(RNA-/Ab+)、慢性(RNA+/Ab+)和假陽性(RNA-/Ab-)。采用Eli

4、sa方法測定血清樣品中IFN-α和IFN-γ含量。HCV RNA陽性樣品通過分析5’-NCR序列進(jìn)行基因分型。結(jié)果,160份初篩HCV抗體陽性的樣品中,自然康復(fù)性樣品45份、慢性感染76份、假陽性39份,HCV自然康復(fù)率約為37.2％。76份HCV定量PCR陽性樣品病毒載量范圍從59.8 IU/ml到2.43×106 IU/ml(中位值3.67×104IU/ml)。63份可基因分型的樣品包括42.9％基因1型、14.3％基因2型、19.

5、0％基因3型和23.8％基因6型。1型為主要基因型,6型主要分布在廣東樣品中。通過對(duì)自然康復(fù)性、慢性、假陽性獻(xiàn)血者的臨床信息(性別、年齡)、HCV抗體水平、血清中IFN含量與HCV基因型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),三組HCV感染狀態(tài)獻(xiàn)血者在年齡(x2=12.212,p=0.002)、HCV抗體水平(S/CO值)(x2=74.584,p<0.001)、IFN-γ含量(x2=14.783,p=0.001)和IFN-α與IFN-γ比值(IFN-α/γ ra

6、tio)(x2=22.368,p<0.001)上存在顯著差異,自然康復(fù)組年齡的中位數(shù)(26歲)低于慢性感染和假陽性組(30和28歲),IFN-α含量的中位數(shù)略高于其它兩組(雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著,多重比較p=0.197),慢性感染組IFN-γ含量及HCV抗體水平(S/CO值)的中位數(shù)高于自然康復(fù)性和假陽性組,而其IFN-α與IFN-γ比值(IFN-α/γ ratio)的中位數(shù)低于自然康復(fù)性感染和假陽性組。在慢性感染人群中,IFN-γ水平與

7、HCV病毒載量呈相反趨勢(p=0.064),而且,IFN-α/γ比值與HCV病毒載量呈顯著正相關(guān)(p=0.037)。各基因型獻(xiàn)血者中HCV基因2型抗體水平的中位數(shù)高于其它基因型(多重比較p=0.028)。結(jié)論:通過比較中國北京及廣東地區(qū)獻(xiàn)血者自然康復(fù)性、慢性、假陽性HCV感染間的一系統(tǒng)參數(shù),發(fā)現(xiàn)IFN-α應(yīng)答可能在HCV感染自然康復(fù)中起主要作用,而IFN-γ則在HCV慢性感染病毒載量的控制上發(fā)揮作用。IFN-α/γ比值在慢性感染中與病毒

8、載量呈正相關(guān),它可能作為一個(gè)新的測定指標(biāo)用于評(píng)價(jià)HCV感染的遠(yuǎn)期結(jié)果。
　　 本課題第二部分針對(duì)HCV感染尚無理想的小型靈長類動(dòng)物模型這一科學(xué)難題,建立HCV動(dòng)物感染模型探索HCV感染自然轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)制。GB病毒B(GBV-B)是一種最接近HCV的病毒,同屬黃病毒科肝病毒屬。與HCV不同,GBV-B可以感染狨猴(common marmosets,Callithrix jacchue jacchus)并導(dǎo)致急或慢性肝炎,因此是一個(gè)

9、有價(jià)值的模擬HCV感染的替代病毒。但是GBV-B仍然與HCV存在著差異,不能完全模擬丙型肝炎病毒在體內(nèi)的感染與免疫狀態(tài)。因此,以GBV-B基因組為骨架,以來源于獻(xiàn)血者人群中一例HCV1b基因型樣本的HCV功能性基因取代GBV-B的相應(yīng)功能區(qū),構(gòu)建HCV/GBV-B嵌合病毒的狨猴感染模型,探索含HCV完整功能蛋白的嵌合病毒感染自然轉(zhuǎn)歸機(jī)制,可為HCV免疫防制與抗病毒藥物研究提供有效實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型技術(shù)平臺(tái)。
　　 在這部分內(nèi)容中,

10、我們以HCV的完整結(jié)構(gòu)蛋白基因(coreE1E2p7)、完整囊膜蛋白基因(E1E2p7)或主要非結(jié)構(gòu)蛋白基因(NS2NS3NS4A)替換GBV—B相應(yīng)基因構(gòu)建了三種嵌合病毒HCV-CE1E2p7/GBV—B、HCV—E1E2p7/GBV-B、HCV-NS2NS3NS4A/GBV-B,通過肝內(nèi)注射嵌合病毒RNA或靜脈注射含嵌合病毒的原代狨猴血清,建立HCV/GBV-B嵌合病毒狨猴感染模型。接種病毒后連續(xù)監(jiān)測29-37周,每周股靜脈采血,采

11、用定量PCR、巢式PCR鑒定嵌合病毒在狨猴體內(nèi)復(fù)制狀況,同時(shí)測定血清中ALT、HCV抗體反應(yīng)性、IFN-α、IFN-γ含量的變化,采用H&E染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果,肝內(nèi)注射了三種嵌合病毒及GBV-B陽性對(duì)照RNA的狨猴均出現(xiàn)了病毒復(fù)制的情況,病毒復(fù)制周期主要集中在三個(gè)階段,接種病毒后1-6周、8-14周和18-23周。14周之后病毒載量明顯降低,23周之后一直到37周,病毒被清除或無法檢測到。用含有嵌合病毒、GBV-B的狨猴血

12、清分別靜脈接種給其它正常狨猴后,狨猴均出現(xiàn)了傳代病毒復(fù)制的情況,病毒復(fù)制集中在兩個(gè)階段,接種血清后1—5周和10-16周,后一階段病毒載量明顯降低,隨后病毒會(huì)被自然清除,直到29周再次檢測到病毒。第29周時(shí),M6(HCV-CE1E2p7/GBV-B傳代感染狨猴)和M9(GBV-B傳代感染狨猴)血清中檢測到病毒,只是病毒載量較低。與原代相比,傳代病毒更容易被清除。原代及傳代嵌合病毒感染狨猴血清中ALT水平隨著病毒的復(fù)制有所升高。另外,從組

13、織病理學(xué)角度來看,原代及傳代嵌合病毒感染狨猴的肝組織均出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤、毛玻璃樣變(細(xì)胞水腫、核偏移、胞漿中有顆粒狀物質(zhì))、膽汁淤積、排列紊亂、水腫等典型病毒性肝炎的組織病理學(xué)變化。通過血清中嵌合病毒的檢測、ALT的升高、肝臟組織中典型的病毒性肝炎的病理學(xué)變化證實(shí)三種嵌合病毒均可在狨猴體內(nèi)復(fù)制并包裝成完整的病毒顆粒?；诔晒Ω腥镜尼鹾?我們監(jiān)測了病毒復(fù)制和清除的整個(gè)過程以及HCV抗體反應(yīng)和IFN水平的變化?？笻CV core抗體可在。H

14、CV-coreE1E2p7/GBV-B原代及傳代感染狨猴接種病毒2周后檢測到?？笻CV E2和NS3的抗體在各感染狨猴中較弱。在病毒復(fù)制和清除的整個(gè)過程中,IFN-γ的水平相對(duì)比較穩(wěn)定,而IFN-α的含量會(huì)在病毒載量變得較低或病毒被清除之后,出現(xiàn)明顯地升高并且持續(xù)數(shù)周時(shí)間。抗體及干擾素在HCV自然轉(zhuǎn)歸中的作用還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。結(jié)論:本研究在國內(nèi)外首次研制成功了HCV完整結(jié)構(gòu)蛋白或主要非結(jié)構(gòu)蛋白與GBV-B的嵌合病毒,建立了狨猴感染模型

15、,記錄了病毒復(fù)制和清除的整個(gè)過程以及HCV抗體反應(yīng)和IFN水平的變化,初步探索了HCV/GBV-B嵌合病毒在狨猴體內(nèi)復(fù)制、持續(xù)與清除,自然轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)制,進(jìn)而為HCV疫苗及抗病毒藥物評(píng)價(jià)提供了有效的小型靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。同時(shí)也引發(fā)了我們關(guān)于HCV感染機(jī)制,包括HCV受體、細(xì)胞嗜性的思考,細(xì)胞受體與病毒問的相互作用可能不是或不完全是限制HCV或GBV-B感染人或狨猴的決定性因素,宿主的其它細(xì)胞嗜性因素還有待發(fā)現(xiàn)。
　

16、　 綜上,本論文一方面針對(duì)中國獻(xiàn)血者人群,通過各樣本問橫向比較,研究了丙型肝炎病毒自然康復(fù)與慢性感染的分子特征。另一方面,利用獻(xiàn)血者人群中一例HCV1b基因型樣本的HCV功能基因構(gòu)建了含HCV完整結(jié)構(gòu)蛋白或主要非結(jié)構(gòu)蛋白基因的GBV-B嵌合病毒狨猴感染模型,實(shí)現(xiàn)了從關(guān)鍵技術(shù)上解決HCV研究缺乏理想的小型靈長類動(dòng)物模型的科學(xué)難題,縱向跟蹤記錄了病毒復(fù)制和清除的整個(gè)過程HCV抗體反應(yīng)性及IFN水平的變化。論文從人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型兩個(gè)角度,