自體樹突狀細(xì)胞疫苗治療乙型肝炎病毒感染者的免疫機制研究.pdf

1、第一章HBcAg/HBeAg對人樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響。 目的： 在已研究的HBsAg對體外培養(yǎng)的人自體樹突狀細(xì)胞治療性疫苗表型和功能的影響基礎(chǔ)上，研究HBcAg/HBeAg對體外培養(yǎng)的人自體樹突狀細(xì)胞治療性疫苗表型和功能的影響。 方法： 1、取20例健康志愿者外周靜脈血，肝素抗凝，以密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞。以GM-CSF，IL-4刺激，常規(guī)培養(yǎng)獲得DC。再分別加入TNF-α、HBcAg+TNF-

2、α、HBeAg+TNF-α刺激后，依次分組為：mDC組、HBcAg+mDC組、HBeAg+mDC組。 2、在培養(yǎng)第10天檢測各組樹突狀細(xì)胞的表型以及分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12p70的變化。 3、mDC組、HBcAg+mDC組、HBeAg+mDC組樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的自體懸浮淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)：在培養(yǎng)第7天與自體懸浮淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)5天，在培養(yǎng)結(jié)束前12h加入1μCi/孔3H甲基胸腺嘧啶，用液體閃爍計數(shù)儀檢測樹突狀細(xì)胞誘

3、導(dǎo)的自體懸浮淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)（cpm值）。 4、mDC組、HBcAg+mDC組、HBeAg+mDC組樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒活性：以HepG2為靶細(xì)胞，在第13天以乳酸脫氫酶法，按CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書，檢測樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒活性。 結(jié)果： 1、分別加入TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后，

4、在光鏡下各組均可見大量具有樹突樣突起的懸浮細(xì)胞，成簇分布。觀察發(fā)現(xiàn)HBcAg+mDC組的樹突狀細(xì)胞聚集最早最明顯，凋亡較多，3天后細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 2、觀察各組中樹突狀細(xì)胞CD83、CD86、HLA-ABC的水平：HBcAg+mDC組和HBeAg+mDC組高于mDC組（P<0.01）；HBcAg+mDC組高于HBeAg+mDC組（P<0.01）。 3、HBcAg和HBeAg可顯著增強mDC分泌IFN-γ、IL-12p7

5、0的量（P<0.01）。IL-12p70的分泌量HBcAg+mDC組低于HBeAg+mDC組。 4、HBcAg+mDC、HBeAg+mDC、mDC組樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞增殖和殺傷效應(yīng)均較顯著，與HBcAg、HBeAg、自體懸浮淋巴細(xì)胞增殖和殺傷效應(yīng)相比有顯著性差異（P<0.01）。HBcAg+mDC、HBeAg+mDC兩組與mDC誘導(dǎo)組之間的增殖和殺傷效應(yīng)也具有顯著性差異（P<0.01）。 結(jié)論： 1

6、、樹突狀細(xì)胞作為治療性疫苗在體外培養(yǎng)，受TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后會有不同程度的分化、成熟或凋亡。 2、隨著樹突狀細(xì)胞的成熟，樹突狀細(xì)胞表達(dá)CD83、CD86、HLA-ABC的水平相應(yīng)有不同程度的提高。 3、隨著樹突狀細(xì)胞的成熟，其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p70的量相應(yīng)有不同程度的增加。 4、隨著樹突狀細(xì)胞的成熟，其體外誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖及殺傷功能均有不同程度的增

7、強。第二章IL-10，TNF-α對慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞的影響。 目的： 研究IL-10和TNF-α對慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞的分化與功能的影響。 方法： 1、健康志愿者和慢性乙型肝炎患者各15例，取外周靜脈血，分離獲得外周血單個核細(xì)胞（PBMC），常規(guī)培養(yǎng)獲得DC組。 2、培養(yǎng)期間用IL-10刺激的為imDC組；TNF-α刺激的為mDC組；先后用IL-10，TNF-α刺激的為imDC+T

8、NF-α組。 3、各組收獲細(xì)胞后分別檢測反映DC成熟度的各種分子及其體外誘導(dǎo)的自體淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。 結(jié)果： 1、源于慢性乙型肝炎患者的常規(guī)培養(yǎng)的DC在數(shù)量，HLA-A，B，C、HLA-DR、CD86表達(dá)，IL-12p70分泌及其誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，均低于健康者組（P<0.01）。 2、mDC組：源于慢性乙型肝炎患者的mDC與健康者mDC表達(dá)的HLA-DR、HLA-A，B，C、CD86比較無顯著性差異

9、；兩組mDC誘導(dǎo)自體淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)和分泌的IL-12p70均明顯增加，比較有顯著性差異（P<0.01）。 3、imDC組：兩組imDC的HLA-A，B，C、HLA-DR、CD86較mDC組低表達(dá)，分泌的IL-12p70極低，不能強烈激活誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，與常規(guī)培養(yǎng)DC組比較有顯著性差異（P<0.01）。 4、imDC+ TNF-α組：加入TNF-α刺激后HLA-A，B，C、HLA-DR、CD86仍低表達(dá)，分泌的IL

10、-12p70和淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)仍較低。 5、健康對照組、慢性乙型肝炎組的上清夜中IL-21的ELISA檢測值均較低，無顯著性差異。 結(jié)論： 1、慢性乙型肝炎患者DC經(jīng)TNF-α刺激后可同健康者一樣高表達(dá)HLA-DR，HLA-A，B，C，CD86，但分泌IL-12p70仍較低，考慮為等量采集靜脈血經(jīng)相同方法培養(yǎng)后慢性乙型肝炎組在懸浮細(xì)胞數(shù)量上明顯少于健康對照組所致。實驗結(jié)果說明慢性乙型肝炎患者DC的狀態(tài)雖然存在缺陷

11、但在TNF-α的刺激下仍可向成熟分化。 2、使用IL-10抑制DC的發(fā)育成熟結(jié)果表明慢性乙型肝炎患者DC的數(shù)量，表達(dá)HLA-DR、HLA-A，B，C、CD86，誘導(dǎo)的自體淋巴細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子與未用IL-10相比有一定差距。 3、IL-10抑制的樹突狀細(xì)胞再加入TNF-α仍能保持不成熟的狀態(tài)，其表面共刺激分子在接受TNF-α刺激后仍低表達(dá)，但是否能在致病微生物等致病抗原的刺激下仍能保持抑制狀態(tài)還有待進一步研究。