丙型肝炎病毒感染的小鼠肝癌細(xì)胞模型研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是有包膜的下鏈RNA病毒,全球約1.7億人口感染HCV,我國的感染人數(shù)高達(dá)3000-6000萬.HCV感染后導(dǎo)致急性和慢性肝炎,約20﹪發(fā)展為肝硬化,并與肝癌的發(fā)生密切相關(guān).HCV只能感染人和黑猩猩等靈長類動物,目前缺乏合適的動物模型和穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),所以對病毒生活周期、致病機(jī)制及新的抗病毒治療方案的評價等進(jìn)展緩慢.一、人LDLR分子真核表達(dá)載體的構(gòu)建.從能感染HCV的人肝癌

2、細(xì)胞系HepG2中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后用人LDLR(hLDLR)基因的特異引物分兩段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到基因片段hLDLR1和hLDLR2.將目的基因hLDLR1和hLDLR2分別經(jīng)用HindⅢ、BalⅡ和BalⅡ、XbaⅠ雙酶切后回收酶切片段,將兩片段共同插入真核表達(dá)載pcDNA3的HindⅢ和XbaⅠ酶切位點之間,構(gòu)建成含全長hLDLR基因的真核表達(dá)載體.二、轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性克隆的篩選及鑒定.將hLDLR真核表達(dá)載體p

3、cDNA3-hLDLR和該室已構(gòu)建的小鼠白蛋白啟動子調(diào)控的人CD81(hCD81)和人Sip-L(hSip-L)的真核表達(dá)載體pcDNA3-AlbEP-hCD81、pcDNA3-AlbEP-hSip-L分別轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞系Hepal-6.G418加壓篩選后，分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平上檢測到穩(wěn)定表達(dá)hCD81分子的陽性細(xì)胞克隆.由于缺乏hLDLR和hSip-L的單克隆抗體，表達(dá)hLDLR和hSip-L的陽性細(xì)胞克隆只是在mRNA水平上

4、做了鑒定.三、HCV感染轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞模型的初步建立.用含10﹪HCV陽性血清的培養(yǎng)基與穩(wěn)定表達(dá)目的分子的小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6在37℃共孵育24h，在染后的第1、3、5、7天分別用套式RT-PCR和間接免疫熒光方法進(jìn)行HCV RNA和蛋白水平上的檢測.RNA檢測顯示在穩(wěn)定表達(dá)hLDLR分子的小鼠肝癌細(xì)胞中.該研究證明hLDLR和hCD81等受體導(dǎo)入小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6能使HCV感染小鼠肝癌細(xì)胞，初步建立了HCV感染的小鼠