丙型肝炎病毒感染的抑制性分子篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球重要的公共衛(wèi)生問題，影響著全世界約3％的人口，每年導(dǎo)致超過35萬的死亡病例。HCV感染慢性化程度非常高，病程進(jìn)展隱匿，終末期患者常伴有慢性肝疾病的發(fā)生，包括肝脂肪變性、肝纖維化，甚至發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌。目前，并無有效的預(yù)防性或治療性疫苗問世。早期治療HCV感染一般采用聚乙二醇干擾素加利巴韋林，療效在不同基因型中差別較大、治療時限較長、不良反應(yīng)較多。近幾年，針對HCV生命周期中特定病毒蛋白的

2、靶向性藥物，又稱直接作用的抗病毒藥物（DAA）得到了飛速的發(fā)展，有效提高了治療患者的持續(xù)病毒應(yīng)答率(SVR)。然而，DAA的使用仍舊受到一些問題的限制，如耐藥突變的產(chǎn)生、藥物附帶的一些不良反應(yīng)、不可忽視的高昂治療費(fèi)用等。因此，對HCV感染過程的進(jìn)一步研究，包括研制針對病毒生命周期不同階段的新型藥物，及解析病毒與宿主相互作用中的關(guān)鍵分子等，都將加深我們對HCV感染機(jī)制的認(rèn)識，也為發(fā)展更高效、耐受性更好的抗HCV藥物提供研究基礎(chǔ)與助力。

3、r>　　HCV的感染包括病毒顆粒的入侵、病毒基因組的翻譯與復(fù)制、成熟病毒顆粒的組裝與釋放這些步驟。目前上市的DAA藥物主要通過抑制病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的成熟或酶的活性進(jìn)而阻斷病毒復(fù)制的過程。然而，這些藥物由于靶向高度變異的病毒成分，其基因屏障相對較低，且難以起到預(yù)防感染的作用，這也是HCV終末期患者肝移植后的病毒再感染率居高不下的一個原因。HCV入侵是一個高度協(xié)調(diào)的多步驟過程，包括病毒的非特異性結(jié)合、與靶細(xì)胞入侵相關(guān)受體的相互作用、病毒內(nèi)吞入

4、靶細(xì)胞及與宿主細(xì)胞間的膜融合。這個過程為抗HCV治療提供了許多新的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)由于多靶向宿主細(xì)胞成分，因此具有較高的基因屏障。由于入侵抑制劑干擾的是病毒生命周期最開始的階段，此時病毒基因組并未釋放，因此具有同時預(yù)防與治療病毒感染的作用。入侵抑制劑與目前的抗HCV藥物聯(lián)合運(yùn)用，即病毒生命周期多個階段的靶向聯(lián)合治療，可能成為未來抗HCV治療的一個主要方向。研發(fā)新型的覆蓋多基因型的高效HCV入侵抑制劑十分必要。
　　HCV的感染會引起

5、宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，多種宿主因子的表達(dá)會發(fā)生變化。在這其中，一些分子表達(dá)水平的變化會進(jìn)一步影響病毒的感染過程。增進(jìn)對這類分子，尤其是具有抑制病毒感染作用分子的認(rèn)識和研究，將大大促進(jìn)抗HCV研究的發(fā)展。非編碼RNA(ncRNA)早前被認(rèn)為在細(xì)胞中并無實(shí)際功能。近幾年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展及研究的深入，越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在各種的生理或病理過程中發(fā)揮著重要作用。其中對長度小于200 bp的微小RNA(miRNA)的研究較多，它的作用

6、方式和機(jī)制目前已經(jīng)解析得較為透徹。在HCV感染中，較為熟悉的有miR-122，它通過與病毒基因組5'UTR區(qū)域的相互作用促進(jìn)病毒的復(fù)制，其抑制劑目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。我室之前也有報道m(xù)iR-221通過靶向干擾素通路抑制性分子來增加IFN的抗HCV的活性。然而關(guān)于長度大于200 bp長鏈非編碼RNA(lncRNA)的研究仍處于初步階段，其在病毒感染中的研究更少之又少，在HCV感染中的作用更無報道。因此，研究lncRNA在HCV感染中的作

7、用將進(jìn)一步完善病毒與宿主相互作用過程的闡述，也為抗病毒藥物提供新的作用靶點(diǎn)。
　　目前抗HCV治療藥物多為針對某一靶點(diǎn)人工合成的化合物，造價昂貴，并可能在人體中產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)。細(xì)胞療法是近期較為流行的治療方法之一，其中又以間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)療法最為常見，它可通過旁分泌一定的生物學(xué)活性物質(zhì)發(fā)揮作用。外泌體就是實(shí)現(xiàn)其旁分泌功能的主要介質(zhì)。研究顯示，外泌體既可在細(xì)胞間傳遞傳染性病原體也可以傳輸保護(hù)性物質(zhì)抑制病原體感染。已有報道稱

8、HCV感染細(xì)胞分泌的外泌體可以傳遞具有感染性的病毒顆粒至其他細(xì)胞。然而，并無攜帶具有抗HCV物質(zhì)外泌體的報道。人干細(xì)胞來源的外泌體是生理培養(yǎng)下的人干細(xì)胞成分，生產(chǎn)成本較低，不良反應(yīng)也較少，是未來再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分。因此，研究其在HCV感染過程中的作用具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　第一部分 抗HCV活性天然化合物的篩選及機(jī)制研究
　　方法:
　　通過HCV體外感染模型，從數(shù)百種天然藥用植物來源的化合物中，高通量篩選出具有抗HC

9、V活性的來源于保肝中藥五味子的四環(huán)三萜類化合物甘五酸(SZA)和來源于抗炎中藥絡(luò)石藤的木脂內(nèi)酯類化合物絡(luò)石藤苷元(TGN)。應(yīng)用不同基因型的單周期HCV假病毒顆粒及原代人肝細(xì)胞，初步分析化合物對病毒入侵的影響。繼而通過病毒動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，精確定位化合物抗HCV的有效靶點(diǎn)。采用密度梯度超速離心法分析化合物對病毒本身脂密度及感染性的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡及病毒結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)排除化合物對HCV靶細(xì)胞表面入侵相關(guān)受體的作用。
　　結(jié)果:

10、
　　SZA和TGN細(xì)胞毒性較小，可顯著抑制細(xì)胞來源的HCV(HCVcc)和HCV假病毒顆粒(HCVpp)感染靶細(xì)胞。SZA和TGN在不同型別的HCVpp中的抑制效果一致，并能阻斷HCVpp入侵原代人肝細(xì)胞。動力學(xué)實(shí)驗(yàn)提示，兩者的作用靶點(diǎn)位于病毒感染早期入侵階段的結(jié)合后步驟。
　　結(jié)論:
　　天然植物來源的SZA和TGN具有顯著的抗HCV感染的活性。兩者的作用機(jī)制為干擾了HCV感染早期的必要步驟即病毒入侵，與目前傳統(tǒng)的

11、DAA的治療靶點(diǎn)不同，可作為HCV感染預(yù)防及對現(xiàn)有療法的補(bǔ)充，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第二部分 抗HCV長鏈非編碼RNA的高通量篩選及機(jī)制研究
　　方法:
　　通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在HCV感染前后差異表達(dá)的系列LncRNA。其中，LncRNA GAS5所有轉(zhuǎn)錄體在HCV感染后都呈高表達(dá)。通過進(jìn)一步過表達(dá)或下調(diào)該LncRNA，發(fā)現(xiàn)GAS5的上調(diào)可以顯著抑制HCV的感染，下調(diào)則促進(jìn)感染。隨后，應(yīng)用單周期HCV假病毒顆粒，排

12、除GAS5對病毒入侵的影響。
　　結(jié)果:
　　GAS5在HCV感染細(xì)胞的胞質(zhì)中高表達(dá)，并隨感染劑量的上升及感染進(jìn)展而升高。在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)GAS5，可顯著抑制HCVcc感染靶細(xì)胞;下調(diào)GAS5的水平則促進(jìn)病毒的感染。GAS5對不同基因型HCV假病毒顆粒(HCVpp)入侵靶細(xì)胞并無明顯抑制效果。在HCV復(fù)制子細(xì)胞中過表達(dá)GAS5后能顯著降低胞內(nèi)病毒RNA水平，干擾GAS5能提高病毒RNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:

13、　　LncRNA GAS5具有顯著的抗HCV的效果，其作用機(jī)制為通過與HCVNS3蛋白的相互作用，干擾NS3蛋白酶的活性，進(jìn)而阻礙病毒的復(fù)制。GAS5在感染中高表達(dá)可能涉及宿主對病毒感染的抵御作用，為闡明抗病毒機(jī)制、發(fā)展抗病毒藥物等提供助力。
　　第三部分 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體抗HCV感染的作用及機(jī)制研究
　　方法:
　　利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(uMSC)的上清及Transwell共培養(yǎng)檢測uMSC旁分泌在HCV感染

14、中的作用。進(jìn)一步分離獲得上清中的外泌體(uMSC-Exo)，明確外泌體在病毒感染中的效果。利用動力學(xué)實(shí)驗(yàn)明確uMSC-Exo在病毒感染生命周期中抑制的階段。通過單周期HCV假病毒顆粒，排除uMSC-Exo對病毒入侵的影響。應(yīng)用電穿技術(shù)將病毒RNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞或HCV復(fù)制子細(xì)胞，評估uMSC-Exo對HCV復(fù)制的影響。
　　結(jié)果:
　　uMSC可通過旁分泌抑制靶細(xì)胞中HCV的感染，且uMSC-Exo是這個過程中主要起效的活性物

15、質(zhì)。uMSC-Exo能有效進(jìn)入Huh7細(xì)胞中，降低感染細(xì)胞的病毒RNA水平和病毒蛋白的表達(dá)。uMSC-Exo對HCV的入侵并無影響，但是能顯著抑制病毒的復(fù)制。蛋白酶K實(shí)驗(yàn)明確uMSC-Exo起效的分子為其內(nèi)的RNA成分。uMSC-Exo的小RNA測序中高表達(dá)的前15個miRNA中，有9個miRNA在uMSC-Exo處理的靶細(xì)胞中高表達(dá)，而功能性實(shí)驗(yàn)提示其中4個miRNA(let-7f、miR-145、miR-199a和miR-221)在

16、uMSC-Exo的抗病毒效果中發(fā)揮主要作用。將這4個miRNA的抑制劑轉(zhuǎn)染uMSC后，其分泌的uMSC-Exo的抗病毒效果明顯下降。將uMSC-Exo與IFN或VX-950聯(lián)合運(yùn)用能協(xié)同抑制HCV的感染。
　　結(jié)論:
　　uMSC-Exo具有顯著的抗HCV的活性，其作用機(jī)制為通過外泌體包裹的具有抗HCV感染作用的miRNA（let-7f、 miR-145、miR-199a和miR-221）抑制病毒的復(fù)制，進(jìn)而阻斷病毒感染。此

17、工作為解析HCV感染的分子機(jī)制及抗病毒治療的發(fā)展提供了新的思路和可能性。
　　結(jié)論:
　　本研究通過高通量篩選天然化合物庫，發(fā)現(xiàn)了具有抗HCV活性的SZA和TGN，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩者分別通過靶向病毒膜融合及入侵關(guān)鍵受體CD81抑制HCV的入侵。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在HCV感染后上調(diào)的lncRNA GAS5，分析其作用機(jī)制為通過與病毒NS3蛋白相互作用，干擾其活性，從而阻礙病毒的復(fù)制。首次發(fā)現(xiàn)uMSC-Exo具有抑制HCV感染的