登革-2型病毒E蛋白結構域Ⅲ表位肽誘導B和T細胞免疫應答的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 登革病毒(Dengue virus,DEN)為黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員,含4個血清型(DEN-1、-2、-3和-4)。登革病毒為單股正鏈RNA病毒,共11kb,其基因組可分為兩部分:5ˋ端1/4的序列編碼病毒的結構蛋白；3ˋ端3/4的序列編碼病毒的非結構蛋白,編碼結構蛋白和非結構蛋白的基因順序為:5ˋUTR-C-prM(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-

2、NS3-NS4a-NS4b-NS5-UTR3ˋ。
　　 登革病毒的感染已成為世界性衛(wèi)生問題。登革病毒感染可引起登革熱(Dengue fever,DF),登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)以及登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS),主要流行于熱帶與亞熱帶地區(qū),每年約新增5億感染病例,全球25億人正面臨著登革病毒的感染。它的傳播媒介主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊,目前,登革

3、的預防主要通過切斷蚊媒傳播,尚無有效的疫苗用于預防。
　　 現(xiàn)今登革疫苗研究較有成效的有減毒活疫苗,嵌合病毒疫苗,重組亞單位疫苗,DNA疫苗等,但都存在安全性差,有效性不高的問題。研制登革疫苗困難的因為主要有:(1)登革病毒的致病機理尚不明確；(2)尚無合適的動物模型模擬DHF/DSS的發(fā)病過程；(3)研制的疫苗需對四個血清型的DEN感染均有保護作用,增加了疫苗研制的難度；(4)研制周期長,潛在的副作用限制等。
　　 現(xiàn)

4、今,新型的多表位肽疫苗成為登革疫苗研究的新方向。自20世紀80年代Strohmaier等人發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒的146-154及200-213位氨基酸序列含有抗原性位點,從而找到了一種新型的疫苗,即表位疫苗。多表位肽疫苗具有安全性好、高度特異性、易保存和使用方便等優(yōu)點。隨著分子免疫學,分子生物學和生物工程信息學的發(fā)展,為病毒尋找抗原性表位提供了捷徑。近年來表位肽疫苗已成為疫苗研究的熱點。在抗病毒表位肽疫苗的研究中,現(xiàn)有HIV(Humanimm

5、unodeficiency virus)、HCV(Hepatitis C virus)和HPV(Human papillomavirus)等多表位肽疫苗進入臨床試驗階段。
　　 理想的多表位肽疫苗需免疫原性強,能誘導機體既產生體液免疫又產生細胞免疫應答。登革病毒的E蛋白(envelope glycoprotein)是公認的可引起機體產生保護性免疫的重要抗原蛋白,其含有可誘導機體產生中和抗體的抗原決定簇。E蛋白為糖蛋白,位于病毒表

6、位構成病毒顆粒表面的突起,以同源二聚體的形式存在,它介導病毒和細胞受體的結合,使病毒進入細胞,發(fā)生感染。E蛋白單體可分為三個結構域(Domain):DⅠ、DⅡ和DⅢ?？笵Ⅱ和DⅢ的抗體都可以表現(xiàn)出中和病毒的作用,但抗DⅢ的抗體表現(xiàn)出極強的中和病毒作用,病毒型特異性更強。
　　 本研究以DEN-2 NGC株E蛋白的DⅢ為研究對象,應用生物信息學技術,通過網絡生物信息學軟件和DNAstar等軟件對E蛋白和E蛋白的B、T細胞表位分析,

7、認為DⅢ免疫原性強和特異性好,其中RHVLGRLITVNPIVTE345～359和EPGQLKLNWFKKGSS E383～397序列最有可能為T和B細胞表位。
　　 在亞單位疫苗的研究中,Consogno等在設計腫瘤多表位肽疫苗的研究中,預測雜合性T細胞表位,Th表位預測的一項重要成果是泛DR表位(pan-DRepitope,PADRE),它是一含13個氨基酸殘基的人造通用型Th細胞表位,序列為AKFVAAWTLKAAA等。實

8、驗證明將PADRE與T表位或B細胞表位串聯(lián)構建的多表位肽疫苗可以誘導高效的細胞或體液免疫應答,而且還發(fā)現(xiàn)PADRE對人體安全,無毒副作用。
　　 本研究將初步驗證的登革病毒E蛋白結構域Ⅲ的T細胞表位(RHVLGRLITVNPIVTE345～359)和B細胞表位(EPGQLKLNWFKKGSS E383～397)連同PADRE串聯(lián)成線性多表位肽結構,中間間隔GG氨基酸序列,用網絡數(shù)據(jù)庫對多表位肽進行分析,合成P1(AKFVAAWT

9、LKAAAGGRHVLGRLITVNPIVTGGEPGQLNWFKKGSS,純度96.5％)線性多表位肽。同時合成一同行對照肽P2(AKFVAAWTLKAAAGGKKSKAINVLGGIGESHFK GLVLI,純度76.7％),其中P2序列中除PADRE序列與P1相同外,其他氨基酸序列為隨意序列。將線性表位肽免疫C57BL/6j小鼠,觀察其誘導體液、細胞免疫應答和保護性效應。
　　 研究方法
　　 1、多表位肽的生物信

10、息學分析
　　 運用在線的網絡服務器http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam分析多表位肽P1的分子量、等電點和穩(wěn)定性分析等情況。運用DNAstar軟件分析多表位肽P1的α螺旋、β折疊、β轉角和免疫原性所在區(qū)段。使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov的網絡BLAST分析,觀察多表位肽氨基酸序列的病毒型特異性。采用http://www.cbs.dtu.dk/service

11、s/SignalP/的網絡服務器預測多表位肽有無信號肽,及對信號肽切割位點進行分析。
　　 2、線性表位肽誘導的體液和細胞免疫應答
　　 SPF級4-6周齡雌性C57BL/6j小鼠共30只,隨機分為P1組、P2組和PBS陰性對照組,每組共10只。每組相應免疫P1和P2,量100μg/只100μL,PBS陰性對照組免疫PBS緩沖液100μL,各免疫原與等體積的弗氏佐劑乳化后,腹部皮下多點注射,免疫三次,每次免疫間隔兩周。分

12、別于免疫前,免疫后第1、2和3次后兩周(即免疫后2、4和6周)剪鼠尾采血,待其凝固后離心取血清,加入等量甘油凍純于-20℃。經間接ELISA檢測不同組別的小鼠于免疫后第2、4和6周的抗體滴度。每組隨機抽取7份免疫血清標本,在2倍稀釋梯度下測OD450nm吸光度A值,以免疫前小鼠血清作陰性對照組。以待測標本Dλ值/陰性對照Dλ九值>2.1為陽性,出現(xiàn)陽性反應的最高稀釋度作為該標木的滴度。
　　 用100TCID50 DEN-2 N

13、GC感染將24孔板內Vero細胞,96小時后固定透化,分別加入不同免疫組別的多抗血清(P1、P2和PBS免疫后多抗血清、免疫前血清和兔抗登革病毒多抗血清)孵育過夜,洗滌后加入FITC-抗小鼠IgG或抗兔IgG,37℃孵育20min后洗滌,熒光顯微鏡下觀察。
　　 同前法免疫小鼠,于末次免疫后兩周分離小鼠脾淋巴細胞,以2.5×106個/mL的細胞溶度種于96孔細胞培養(yǎng)板,分別加入不同刺激原P1和P2各為25μg/mL,半適量PHA

14、 5μg/mL,PBS 5μL/mL,完全培養(yǎng)基陰性對照組,同時設立空白對照組。孵育48小時后,加入CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)5小時后測OD450nm吸光度A值,以公式:刺激指數(shù)=(樣本孔吸光值-空白孔吸光值)/(陰性對照孔吸光值-空白孔吸光值)×100％為準,計算刺激指數(shù)。
　　 按前法將小鼠免疫P1后,分離小鼠脾淋巴細胞種于96孔細胞培養(yǎng)板,加入不同的刺激原(P1和P2各25μg/mL,PBS 5μL/mL,重復例數(shù)為4),孵

15、育6小時后,按細胞因子染色試劑盒說明書操作方法對脾淋巴細胞進行細胞內因子染色,后上流式細胞儀檢測。
　　 3、線性表位肽的保護性研究
　　 小鼠共20只,免疫法同前,分為P1、P2和PBS免疫組及空白組,每組共5只,腹腔注射感染DEN-2 NGC株2×109copies/只100μL,于感染后第1、3和5天剪鼠尾采血150μL,Trizol法提取全血總RNA,逆轉錄RNA為cDNA后,用絕對定量Real-time PCR

16、法測定病毒載量。
　　 隨機抽取不同免疫組別(P1、P2和PBS免疫組)末次免疫多抗血清3份,做2倍稀釋梯度,從1:2至1:128,同時用完全培養(yǎng)基為陰性對照組。將100TCID50病毒懸液與不同稀釋度的實驗血清等體積混合,37℃水浴孵育1小時后感染已鋪種Vero細胞的96孔培養(yǎng)板內。孵育后棄病毒上清液,加入含4％FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5％CO237℃細胞培養(yǎng)箱內。每日顯微鏡下觀察細胞病變,共觀察7天,能抑制病變的50

17、％的血清稀釋度即為陽性。
　　 結論
　　 1、生物信息學分析表明,表位肽P1具有型特異性、免疫原性和信號肽結構。
　　 2、P1為完全抗原,即有免疫原性又有反應原性。P1肽可誘導小鼠產生極高的抗體滴度,同時免疫后的雙表位抗血清可與登革病毒結合。P1作為刺激原,可誘導脾淋巴細胞發(fā)轉化,使Th0細胞向Th1細胞漂移,以增加CTL細胞效應。
　　 3、免疫P1的C57BL/6j小鼠可以產生中和DEN-2 NG