登革病毒非結構蛋白1和包膜蛋白Ⅲ區(qū)B細胞表位研究.pdf

1、由登革病毒(dengue virus， DENV)所致的登革熱是熱帶和亞熱帶地區(qū)主要的公共衛(wèi)生問題，在我國南方地區(qū)，特別是東南沿海各省幾乎每年均有登革熱流行。DENV有4種血清型依次為DENV-1、-2、-3和-4。任何一種血清型的感染均可引起一系列的臨床癥狀，包括隱匿性感染、典型登革熱(DF)以及危脅生命的登革出血熱(DHF)或登革休克綜合征(DSS)。初次感染DENV后，對于同型病毒的再次感染可產生長久的免疫力，但Ⅰ～Ⅳ型DENV之

2、間缺乏交叉免疫保護作用，因而生活在疫區(qū)的每個人一生中都有可能面臨Ⅰ～Ⅳ型DENV感染的威脅。流行病學調查結果顯示再次感染異型DENV是導致DENV感染患者發(fā)生DHF/DSS的重要危險因素，由于在一個地區(qū)存在不同血清型DENV的交替流行，人群普遍易感，這就更增加了DHF/DSS發(fā)生的可能性，也是目前研制特異性登革疫苗的主要障礙。
　　 當前人類對登革熱的防治面臨著許多難題，沒有特異性的治療藥物和安全有效的疫苗，但及時采取臨床救治措

3、施可以大大減少DHF/DSS的發(fā)病率和死亡率，由于多數(shù)DENV感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流感樣癥狀，難以跟其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，必須依賴實驗室的診斷加以確認。然而，當前實驗室診斷存在眾多問題：病毒分離培養(yǎng)和RT-PCR等檢測技術影響因素多，需要昂貴儀器、專門的操作場地及熟練技術人員，不利于推廣；黃病毒屬病毒間抗體具有廣泛的交叉反應性，血清學檢測抗體的方法難以區(qū)分是黃病毒屬疫苗接種的結果還是DENV感染結果。因

4、此，研制疫苗和早期診斷免疫試劑是目前登革熱防治的迫切任務。針對當前DENV感染防治中存在的問題，本課題旨在鑒定DENV蛋白中可作為診斷靶標和疫苗候選蛋白的B細胞表位，為研制DENV感染診斷試劑和疫苗的奠定基礎。
　　 DENV非結構蛋白1(NS1)具有良好的免疫原性，能夠誘導產生保護性的體液免疫和細胞免疫，是DENV疫苗研制的靶標。NS1上既有血清型特異性表位，同時也存在Ⅰ～Ⅳ型DENV交叉反應性表位，是一種理想的早期分型診斷標

5、志物。DENV包膜(E)蛋白中第三功能區(qū)(EⅢ)是一個相對獨立和完整的區(qū)域，暴露于病毒顆粒表面，是E蛋白中誘導中和抗體的主要區(qū)域，針對EIII的特異性抗體是拮抗病毒與宿主細胞結合的最強拮抗劑，因此，EⅢ是DENV特異性亞單位疫苗的主要候選。了解病毒蛋白表位及其如何誘導保護性和致病性免疫應答將有助于研制有效疫苗和診斷試劑。本研究首先采用Ⅰ～Ⅳ型重組DENVNS1蛋白和對應的同型DENV分別免疫小鼠制備針對Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的交叉性單抗

6、、每種血清型特異性單抗和動物免疫血清，這些小鼠單抗和免疫血清同覆蓋DENV-1NS1蛋白的重疊多肽反應，鑒定DENV-1NS1上的B細胞表位和優(yōu)勢表位：接著采用畢赤酵母表達的重組DENV-1EIII免疫小鼠，制備針對Ⅰ～Ⅳ型DENVEIII的交叉性中和單抗和DENV-1血清型特異性中和單抗，采用針對DENV-1EⅢ中和單抗同覆蓋DENV-1EⅢ蛋白的重疊多肽反應鑒定DENV-1E蛋白EⅢ上中和B細胞表位。以上研究為研制DENV感染的診斷

7、試劑和疫苗提供依據。
　　 本研究的目的在于：(1)全面分析DENV-1NS1蛋白的B細胞表位：(2)精確定位DENV-1E蛋白EIII中和B細胞表位。這些DENV蛋白上的B細胞表位為研制DENV診斷試劑和疫苗奠定基礎。
　　 本研究分為3個部分：
　　 第一部分：DENV NS1單抗、DENV-1 EIII單抗以及免疫動物血清的制備與鑒定
　　 首先采用Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1重組蛋白及其對應同型DENV

8、分別免疫Balb/c小鼠，制備鑒定針對Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的交叉反應單抗、每種血清型特異性單抗和對應的動物血清。從9只DENV-1NS1免疫小鼠，4只DENV-2NS1免疫小鼠，4只DENV-3NS1免疫小鼠，10只DENV-4NS1免疫小鼠中共獲得抗DENVNS1單抗149株和對應的27只NS1小鼠免疫血清，這些單抗Ig亞類大多數(shù)為IgG1，其中25株DENV-1NS1血清型特異性單抗，20株DENV-2NS1血清型特異性單抗，15

9、株DENV-3NS1血清型特異性單抗和15株DENV-4NS1血清型特異性單抗，其它74株交叉反應性單抗以不同的方式同Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1反應。
　　 接著采用DENV-1EIII重組蛋白為免疫原，免疫Balb/c小鼠，制備抗DENV-1EIII單抗，鑒定單抗的免疫學特性、中和活性和交叉反應性。共制備抗DENV-1EIII單抗37株，36株單抗具有中和活性，這些單抗亞類大多數(shù)為IgG1。這些中和單抗中，其中17株DENV-1血

10、清型特異性單抗，9株Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉反應性單抗，其它10株交叉反應性單抗以不同的方式同Ⅰ～Ⅳ型DENVEⅢ反應。
　　 這些單抗和動物免疫血清為下一步研究蛋白的B細胞表位奠定了基礎。
　　 第二部分：DENV-1 NS1 B細胞表位的鑒定
　　 149株來源于Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的針對Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的交叉單抗、每種血清型特異性單抗和對應的27只小鼠免疫血清與一組覆蓋DENV-1NS1蛋白的重疊1

11、5肽反應，分析DENV-1NS1的B細胞表位。在25株DENV-1血清型特異性單抗中大多數(shù)單抗同DENV-1NS1的3個區(qū)域反應，對應DENV-1NS1氨基酸殘基序列依次位于第1-15、71-85和338-352。蛋白序列比對分析表明以上3個DENV-1血清型特異性抗體識別表位在黃病毒屬病毒或Ⅰ～Ⅳ型DENV無共同序列，在目前已報道的DENV-1分離株中高度保守，提示這3個區(qū)域是DENV-1血清型特異性B細胞表位。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交

12、叉單抗鑒定DENV-1NS1上5個Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細胞表位，位于DENV-1NS1氨基酸殘基第21-35、111-125、191-205、261-275和291-305。蛋白序列比對分析表明以上Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細胞表位中的25VHTWTEQYKFQ35、112KYSWKSWGKAK122、193AVHADMGYWIES204、266GPWHLGKLE274和294RGPSLRTTT302在已報道的Ⅰ～Ⅳ型DENV分離

13、株中高度保守，提示這5個表位是Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細胞表位。DENV-1NS1免疫小鼠血清反應結果表明位于DENV-1NS1氨基酸殘基第1-15和21-35的2區(qū)域具有高度的免疫反應性，提示以上2區(qū)域是DENV-1NS1上優(yōu)勢B細胞表位，DENV-1NS1第1-15是優(yōu)勢DENV-1血清型特異性免疫B細胞表位。DENVNS1上氨基酸殘基第111-125、191-205和261-275在每種血清型DENVNS1免疫動物血清中均表現(xiàn)出

14、強的免疫原性，提示以上3個區(qū)域是DENVNS1上優(yōu)勢Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細胞表位。這些NS1上免疫優(yōu)勢的DENV-1血清型特異性B細胞表位和Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細胞表位可能有助于研制DENV疫苗和診斷試劑。
　　 第三部分：DENV-1EⅡI中和B細胞表位鑒定
　　 36株針對DENV-1EIII中和單抗同兩組分別覆蓋DENV-1EⅢ的重疊反應多肽(12肽和16肽)反應定位DENV-1EⅢ上的誘導中和抗體的B

15、細胞表位。17株DENV-1血清型特異性中和單抗中2株分別同DENV-1EⅢ的2個區(qū)域反應，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基序列第329-348和381-392。蛋白序列比對分析表明以上兩區(qū)域黃病毒屬病毒或Ⅰ～Ⅳ型DENV無共同序列，僅DENV-1E蛋白氨基酸殘基第381-392在目前已報道的DENV-1分離株中高度保守，提示DENV-1E蛋白氨基酸殘基第333-348是DENV-1分離株特異性中和B細胞表位，第381-392是DENV

16、-1血清型特異性中和B細胞表位。9株Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和單抗中7株同DENV-1EⅢ的1個區(qū)域反應，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基序列第309-320，蛋白序列比對分析表明DENV-1E蛋白中310KEVAETQHGT319在已報道的Ⅰ～Ⅳ型DENV分離株中高度保守，氨基酸殘基替代發(fā)現(xiàn)DENV-1中E309、V312、A313和V320不影響蛋白抗原性，提示該位點是Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B細胞表位。這些DENV-1 E蛋

17、白EIII上中和B細胞表位可能有助于研制新的DENV亞單位疫苗。
　　 小結：
　　 綜合以上三個部分的研究結果，本研究的發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新點如下：
　　 一、采用一組來源于Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的每種血清型特異性單抗、交叉單抗和免疫血清全面分析DENV-1NS1的B細胞表位。精確定位3個DENV-1NS1血清型特異性B細胞表位分別位于NS1蛋白氨基酸殘基第1-15、71-85和338-352位氨基酸。蛋白序列比對分析表

18、明這3個DENV-1血清型特異性B細胞表位在已報道的DENV-1分離株中高度保守，其中aa1-15在DENV-1NS1免疫小鼠血清中有很強的抗原性，是免疫優(yōu)勢DENV-1NS1血清型特異性B細胞表位。精確定位Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1共同交叉表位的依次位于NS1蛋白氨基酸殘基第21-35、111-125、191-205、261-275和291-305位氨基酸。以上5個Ⅰ～Ⅳ型DENV NS1共同交叉表位中25VHTWTEQYKFQ35、11

19、2KYSWKSWGKAK122、193AVHADMGYWIES204、266GPWHLGKLE274和294RGPSLRTTT302在已報道的Ⅰ～Ⅳ型DENV分離株中高度保守，其中區(qū)域111-125aa、191-205aa和261-275aa在各型DENV-NS1免疫血清中有強的抗原反應性，區(qū)域aa21-35在DENV-1NS1免疫小鼠血清和DENV-2NS1免疫小鼠血清中具有很強的抗原反應性。這些新發(fā)現(xiàn)的NS1血清型特異性和Ⅰ～Ⅳ型共

20、同交叉的B細胞表位將有助于DENV疫苗和分型診斷試劑盒的研制。
　　 二、采用一組來源于DENV-1E蛋白EⅢ的中和單抗分析DENV-1E蛋白EⅢ誘導中和抗體的B細胞表位。精確定位1個DENV-1血清型特異性中和B細胞表位，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基第381-392位氨基酸，蛋白序列比對分析表明該表位在已報道的DENV-1分離株中高度保守。精確定位1個Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B細胞表位，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基