登革2型病毒包膜E蛋白中和表位的確定及其功能分析.pdf

1、在登革病毒編碼的三種結構蛋白中，包膜E蛋白是病毒的主要結構蛋白，位于成熟病毒顆粒表面，構成病毒顆粒的突起。E蛋白在空間上形成3個不同的結構域(I，Ⅱ和Ⅲ區(qū))，在病毒吸附、與宿主細胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要的作用。而且，E蛋白也是病毒的主要抗原，含有多種抗原表位，可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保、護性免疫應答，在機體抵御登革病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。然而，登革病毒E蛋白，特別是Ⅲ區(qū)外的構象型中和表位的精細結構尚未完全闡明。其次，不同型

2、和同一型毒株之間在抗體結合位點上的差異及其對病毒組織嗜性、復制效率及致病性等的影響也還有待于進一步分析。此外，E蛋白上與登革病毒免疫病理密切相關的ADE表位也知之甚少。這些問題阻礙了對登革病毒致病和免疫分子機理的闡明。因此，確定登革病毒E蛋白中和表位和ADE表位，闡明抗體中和作用的分子機制，以及進一步探討與E蛋白重要生物學功能相關的一些關鍵氨基酸殘基，不僅是了解其分子機制的第一步，也為登革特異性防治提供重要信息。
　　 本項研究

3、利用登革2型病毒E蛋白特異單抗，分析了病毒E蛋白的中和表位，明確了抗體結合的關鍵位點及其中和作用的機制，并初步探討了重要氨基酸位點突變對病毒生物學特性的影響。研究主要包括四個部分：
　　 一、登革2型病毒包膜E蛋白特異單克隆抗體的制備
　　 為了制備登革2型病毒E蛋白特異單抗，我們分別以滅活的登革2型病毒和構建的病毒全長prM-E基因的真核重組質粒DNA作為免疫原，采用常規(guī)方法建立分泌登革2型病毒E蛋白單抗的雜交瘤細胞系

4、。最終獲得了10株登革2型病毒特異單抗(2B8、2H11、2D7、2F2、2F10、2A10G6、2B4、2D5、4C10和6B4).
　　 為了對這10株單抗所針對的病毒蛋白進行鑒定，我們以穩(wěn)定表達登革2型病毒prME蛋白的細胞制備的抗原片對其進行IFA檢測。結果證實，這10株雜交瘤細胞所分泌的單抗均是針對prM-E抗原的。然后，以大腸桿菌表達的E蛋白Ⅰ-Ⅱ區(qū)或Ⅲ區(qū)為抗原，采用免疫印跡和ELISA法鑒定單抗所針對的抗原表位。結

5、果發(fā)現(xiàn)，除2A10G6和2F10結合E蛋白I-Ⅱ區(qū)外，其余單抗均針對E蛋白Ⅲ區(qū)。此外，對這些單抗的交叉反應活性測定結果顯示，2B8、2H11、2D7和2F2是登革2型病毒特異的，而其余6株均具有黃病毒交叉反應活性。上述結果表明，我們獲得了針對登革2型病毒E蛋白不同的結構域、對黃病毒屬成員具有不同反應性的單抗，為E蛋白抗原表位分析、登革新的診斷試劑以及新型疫苗和抗病毒藥物研究提供重要工具。
　　 二、登革2型病毒E蛋白特異單克隆抗

6、體的中和作用機制
　　 我們采用蝕斑中和減少試驗和乳鼠保護試驗觀察這10株登革2型病毒E蛋白特異單抗的中和活性和保護作用。結果顯示，三株單抗(2B8、2A10G6和2F10)對登革2型病毒具有較強的中和活性和免疫保護作用。其中E蛋白I-II區(qū)特異單抗2A10G6強于Ⅲ區(qū)特異單抗2B8，該抗體可在登革病毒感染4h和24h后分別使66.7％和40%的小鼠存活。此外，單抗2A10G6還有效中和登革l、3和4型、黃熱和西尼羅病毒，與目前

7、已知的黃病毒交叉中和抗體比較，具有更加廣譜的黃病毒交叉中和活性。
　　 為了確定登革病毒E蛋白特異抗體中和作用的機制，我們采用定量RT-PCR法和蝕斑法測定單抗(2B8和2A1OG6)是在病毒增殖周期中的哪一個階段抑制病毒的感染。結果顯示，2B8主要抑制登革病毒增殖周期中的吸附階段，抑制倍數(shù)達3.1；而2A10G6可在病毒吸附后的病毒E蛋白與宿主細胞膜融合階段發(fā)揮其中和作用。上述結果說明，這2株中和抗體可通過結合其不同的中和表位

8、在病毒增殖周期的初期階段抑制登革病毒的感染。另一方面，我們在人單核細胞K562上觀察了亞中和濃度的單抗2A10G6是否可增強登革1-4型病毒對表達Fcy受體的單核細胞的感染。結果發(fā)現(xiàn)，亞中和濃度的單抗2A10G6可增強4個型登革病毒對單核細胞的感染，增加倍數(shù)達5-10倍，表明該中和抗體具有感染增強活性。
　　 三、登革2型病毒E蛋白中和表位的篩選與鑒定
　　 為了分析登革病毒E蛋白中和表位，我們首先采用噬菌體隨機肽庫對單

9、抗2A10G6結合的多肽進行篩選。結果顯示，該單抗所對應的多肽序列位于登革2型病毒E蛋白融合多肽的98DRXW101區(qū)域。采用ELISA法進一步證實了相應的合成多肽可與單抗2A10G6特異結合。序列比對發(fā)現(xiàn)，該多肽序列在所有黃病毒的E蛋白氨基酸序列中是高度保守的。根據(jù)E蛋白晶體結構，我們發(fā)現(xiàn)由D98、R99和W101位氨基酸殘基可構成一個2A10G6結合的構象型表位，該表位暴露在登革2型病毒E蛋白Ⅱ區(qū)頂端融合多肽的表面，且其空間構象在不

10、同黃病毒E蛋白結構中是較為保守的。
　　 為了確定單抗2A10G6與E蛋白結合的關鍵位點，我們利用免疫印跡觀察D98、R99和W101位突變對抗體結合活性的影響。結果顯示，當D98R和R99G單獨突變時，2A10G6與E蛋白的結合不受影響；當W101R突變時，2A10G6幾乎不能與E蛋白結合。當這些氨基酸位點組合突變時，2A10G6結合活性基本上喪失。表明登革病毒E蛋白融合多肽內的W101位可能是2A10G6與其結合的關鍵位點,

11、而D98和R99位氨基酸對抗體結合也可產(chǎn)生一定的影響。
　　 此外，我們通過抗體壓力篩選和蝕斑純化，獲得了1株可逃逸單抗2A10G6中和的突變株。序列測定發(fā)現(xiàn)，該突變株在登革2型病毒E蛋白第126位處氨基酸發(fā)生了突變(Glu→Lys)，表明登革2型病毒E蛋白126位氨基酸是單抗2A10G6特異識別的氨基酸位點，該位點可與D98、R99和W101位共同形成2A10G6表位。同時，這株逃逸株具有與親本株相似的病毒復制效率，但乳鼠神經(jīng)

12、毒力明顯降低，表明E蛋白126位氨基酸是登革2型病毒的毒力相關位點。
　　 四、登革2型病毒E蛋白特異嵌合抗體的構建及其生物學特性
　　 為了探討抗體Fc區(qū)介導的效應器功能以及為下一步構建人源化抗體提供理論依據(jù)，我們首先用5’RACE法測定并預測了鼠源抗體2A1OG6的輕重鏈可變區(qū)序列中可能的互補決定區(qū)(Complementarity-determining region，CDR)和框架區(qū)(Frameworkregion

13、，F(xiàn)R)。結果顯示，重鏈可變區(qū)的3個CDR區(qū)氨基酸序列依次為EYTMH、GIDPNNGGTNYNQKFKG和RDYYALDY；輕鏈可變區(qū)的3個CDR區(qū)氨基酸序列依次為KASQHVGSAVA、SASNRYT和QQYNSYPT。在此基礎上，我們分別構建了嵌合抗體輕重鏈的真核表達載體，共轉染CHO細胞，經(jīng)G418壓力篩選獲得可穩(wěn)定分泌登革病毒E蛋白特異嵌合抗體的細胞株，且該抗體具有與親本鼠源抗體相似的抗原結合和中和活性。
　　 本研究