豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP1非結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞表位和ORF3-7結(jié)構(gòu)蛋白T細(xì)胞表位的解析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是嚴(yán)重威脅世界各國養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。PRRSV感染可引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病，并導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制。PRRSV分為歐洲型和美洲型兩個(gè)血清型，病毒基因組ORF1編碼13種非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2-7編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白，其中NSP1能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子活性和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本研究成功制備出

2、6株針對(duì)NSP1蛋白的單克隆抗體，并鑒定獲得兩個(gè)線性表位（54-59aa和157-163aa）和一個(gè)不連續(xù)性表位(185-232aa)。同時(shí)，利用生物信息學(xué)和IFN-γ ELISPOT試驗(yàn)在ORF3-7編碼蛋白上鑒定出7個(gè)T細(xì)胞表位，并根據(jù)T、B細(xì)胞表位設(shè)計(jì)合成兩種新的抗原分子。構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒，可以有效表達(dá)目的蛋白，小鼠基因免疫試驗(yàn)證明，SynBT2重組質(zhì)粒DNA可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，為PRRSV疫苗研究奠定重要基礎(chǔ)

3、。
　　 主要研究內(nèi)容分為以下4個(gè)部分:
　　 1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP1非結(jié)構(gòu)蛋白原核表達(dá)與單克隆抗體研制
　　 根據(jù)GenBank Accession No.EU144079，設(shè)計(jì)針對(duì)PRRSV SY0608 NSP1基因的特異性引物，擴(kuò)增獲得長1149bp的特異性DNA片段。將目的片段克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中，通過IPTG誘導(dǎo)含pET-32a-NSP1的大腸桿菌BL21，證明重組蛋白獲得有

4、效表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot分析證明，NSP1可以自身裂解形成NSP1α和NSP1β。37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白主要形成包涵體，以NSP1全長蛋白的形式存在。18℃條件下誘導(dǎo)，重組NSP1蛋白可以完全裂解為NSP1α和NSP1β。Western blot分析表明，重組蛋白均可被豬源PRRSV陽性血清所識(shí)別。將純化的重組NSP1蛋白與等量弗氏佐劑乳化，經(jīng)頸背部多點(diǎn)皮下注射免疫BALB/c小鼠3次后，取脾細(xì)胞與SP

5、2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA、Western blot和IFA，篩選獲得PRRSV NSP1抗體陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過3次亞克隆后，最終獲得6株能穩(wěn)定分泌抗NSP1抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。間接ELISA、IFA和Western blot鑒定表明，這6株單克隆抗體均能夠特異地識(shí)別NSP1蛋白，能夠識(shí)別感染MARC-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）的美洲型PRRSV，并產(chǎn)生特異性的熒光，而單抗1H7、3C7和4H2不能特異性識(shí)別

6、感染PAM細(xì)胞的歐洲型PRRSV，該研究為NSP1抗原表位鑒定和PRRS診斷奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP1非結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞表位的鑒定
　　 設(shè)計(jì)36個(gè)截短N(yùn)SP1基因片段，以pET-32a-NSP1為模板，通過PCR擴(kuò)增所有片段，克隆至pET-32a載體中。利用大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)36個(gè)重組截短N(yùn)SP1蛋白。通過間接ELISA和Western blot方法精確定位單克隆抗體所識(shí)別的表位，結(jié)果為

7、:單抗4H2能夠識(shí)別NSP1α的E(54) EPLRW(59)，單抗2G5、3E11和4D4識(shí)別NSP1α的H(157)VLTNLP(163)。單抗3C7和1H7識(shí)別NSP1β蛋白的185aa-232aa位點(diǎn)，該表位為不連續(xù)性表位。為了進(jìn)一步證明所鑒定的表位是否準(zhǔn)確，合成2個(gè)肽段(SP)E(54)EPLRW(59)和H(157)VLTNLP(163)，采用Pepscan的方法分析發(fā)現(xiàn)，單抗4H2能夠識(shí)別肽段E(54)EPLRW(59)，

8、單抗2G5、3E11和4D4能夠識(shí)別肽段H(157)VLTNLP(163)。鑒定的3個(gè)NSP1表位均能夠與PRRSV陽性血清反應(yīng)，但免疫反應(yīng)較弱。不同PRRSV毒株序列分析發(fā)現(xiàn)，表位E(54)EPLRW(59)在15株北美型PRRSV中高度保守，而與歐洲型毒株相比變異較大;表位H(157) VLTNLP(163)在19株P(guān)RRSV中均高度保守，在歐洲型毒株中僅有一個(gè)氨基酸的變異(L162→S162);表位185-232aa在美洲型毒株中

9、相對(duì)保守，與歐洲型毒株相比變異較大。以上結(jié)果豐富了PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1抗原表位圖譜，為進(jìn)一步研究NSP1蛋白相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3-7結(jié)構(gòu)蛋白T細(xì)胞表位的解析
　　 本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測該病毒GP3、GP4、GP5、M和N結(jié)構(gòu)蛋白上可能的T細(xì)胞表位，合成24條9個(gè)氨基酸多肽。同時(shí)，利用24頭清潔級(jí)仔豬接種PRRSVSY0608毒株，于接種后42和63 d采血分離外周血淋

10、巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，并用上述多肽進(jìn)行刺激，通過ELISPOT試驗(yàn)檢測多肽刺激后特異性IFN-γ的分泌量，結(jié)果為:24條多肽中有7條多肽可以刺激PBMC細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，證明其為T細(xì)胞表位，分別位于GP3蛋白的106-114aa(GP3-3)、GP4蛋白的8-16aa(GP4-3)、GP5蛋白的119-127aa(GP5-1)和151-159aa(GP5-2)、M蛋白的43-51aa(M-1)和106-116aa（M-2），N蛋白的25-3

11、3aa(N-1)，其中，4個(gè)表位為首次發(fā)現(xiàn)。將表位序列在不同毒株的PRRSV序列中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GP3-3、M-1、M-4和N-1在美洲型毒株中完全保守，GP4-3、GP5-1和GP5-2在不同美洲型毒株中存在1-4個(gè)氨基酸的變異。本研究鑒定的T細(xì)胞表位為設(shè)計(jì)開發(fā)新型抗PRRSV疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白B\T細(xì)胞表位基因疫苗抗原分子設(shè)計(jì)與免疫特性研究
　　 根據(jù)GP3、GP4、GP5和M結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)

12、胞表位富集區(qū)和T細(xì)胞表位基因序列，設(shè)計(jì)兩種基因組合的DNA分子，不同表位之間插入柔性氨基酸，基因序列按照豬源偏嗜性密碼子進(jìn)行優(yōu)化處理。利用真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB和pVAX1-SynT，Western Blot試驗(yàn)結(jié)果證明pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB表達(dá)蛋白具有PRRSV抗原性。取70只Balb/c小鼠，分

13、為7組，每組10只。第1、2、3、4、5和6組分別腿部肌肉注射免疫pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB、pVAX1-SynT、pVAX1-SynGP5/GP4-5和pVAX1質(zhì)粒DNA，劑量為每只小鼠免疫100μg，第7組為陰性對(duì)照組，注射PBS。首免后21、42 d分別以相同的劑量加強(qiáng)免疫。首次免疫后42和63 d采血測定PRRSV特異性ELISA抗體和中和抗體，同時(shí)，取脾臟分離淋巴細(xì)胞測定淋巴細(xì)胞

14、增殖反應(yīng)，并測定脾臟淋巴細(xì)胞體外刺激后細(xì)胞因子應(yīng)答，結(jié)果為:首免后9周pVAX1-SynBT1、 pVAX1-SynBT2和pVAX1-SynGP5/GP4-5免疫組小鼠均能夠產(chǎn)生PRRSV特異性抗體以及細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中，pVAX1-SynBT2免疫組的PRRSV特異性ELISA抗體和中和抗體水平明顯高于其它組，其PRRSV抗原刺激產(chǎn)生的IL-4及IFN-γ細(xì)胞因子應(yīng)答均顯著高于其它各免疫組。該研究結(jié)果表明，SynBT2重組質(zhì)粒DNA