羽毛降解菌枯草芽孢桿菌B-3的分離鑒定及角蛋白酶基因的克隆表達.pdf

1、角蛋白酶( keratinase)是一種能特異降解角蛋白的蛋白酶。近年來隨著角蛋白酶在去垢劑的制造、皮革加工、食品工業(yè)和飼料生產(chǎn)中廣泛的應用而日益受到人們的青睞。本文以四川農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)雞場堆砌廢棄羽毛處采集的土壤為樣品，篩選出一株可以利用羽毛并能高效降解羽毛粉的枯草芽孢桿菌，并克隆了其kerC基因和實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中融合表達。
　　 1.從四川農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)雞場長期堆砌廢棄羽毛處采集的土壤中篩選出了具有降解角蛋白能力的7株細菌。

2、對其中產(chǎn)角蛋白酶酶活的最高的B-3菌株進行了形態(tài)觀察、生理生化特性以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定B-3為枯草芽孢桿菌，該菌發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶酶活力可達2.261U/mL。
　　 2.利用PCR技術(shù)克隆了編碼枯草芽孢桿菌B-3的角蛋白酶基因。該基因序列全長1146bp，編碼381個氨基酸，含信號肽序列。與GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)該基因與數(shù)據(jù)庫中來自枯草芽孢桿菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.: EU362730)相似

3、性達到100％。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，kerC含兩個絲氨酸蛋白酶家族的保守結(jié)構(gòu)域，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員。
　　 3.以克隆的枯草芽孢桿菌B-3角蛋白酶基因為基礎(chǔ)，利用大腸桿菌表達載體pET-32a(+)構(gòu)建kerC原核表達載體pET-kerC，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導表達。結(jié)果表明，該酶在大腸桿菌中獲得了高效表達，在重組菌細胞裂解上清液中檢測到角蛋白酶活性，酶活力可達14.814U/mL，比活力可達0.0852 I