普魯蘭酶基因克隆表達(dá)及枯草芽孢桿菌基因組的改造.pdf

1、普魯蘭酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是一種解支酶，能夠?qū)Ｒ恍郧虚_普魯蘭糖、可溶性淀粉、支鏈淀粉和一些寡聚糖中的α-1，6-糖苷鍵，應(yīng)用于淀粉加工工業(yè)中，可極大提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率。普魯蘭酶既可以單獨使用，亦可與其它酶配合使用以收到良好的效果。目前已廣泛地應(yīng)用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和啤酒生產(chǎn)中。本實驗研究了來源于地衣芽孢桿菌Bacillu.licheniformis(ATCC14580)普魯蘭酶基因amyX的克

2、隆及其在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。
　　 革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌Bacillu.subtilis是一種(generall.recognize.a.safe)GRAS無內(nèi)毒素的有機體，分泌能力強，能將目標(biāo)蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，使得蛋白純化更容易。因此，在胞內(nèi)形成的包涵體就會減少，產(chǎn)生更多折疊正確、有活性的酶，且無密碼子偏好性。因此，Bacillu.subtilis已經(jīng)成為發(fā)酵工業(yè)中優(yōu)選的表達(dá)菌株。
　　 但枯草芽孢

3、桿菌表達(dá)系統(tǒng)也有其局限性，質(zhì)粒在復(fù)制時經(jīng)常出現(xiàn)不穩(wěn)定的單鏈(ssDNA)形式，從而導(dǎo)致質(zhì)粒載體的丟失。復(fù)制過程中的某些環(huán)節(jié)對結(jié)構(gòu)的重排表現(xiàn)得比較敏感，因此這種變化經(jīng)常發(fā)生在重組的質(zhì)粒中。避免質(zhì)粒不穩(wěn)定性的有效途徑之一是使用整合質(zhì)粒，整合載體的構(gòu)成常包括(1)ori，大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起點(通常為pBR322或其衍生質(zhì)粒)，在枯草芽孢桿菌中不發(fā)揮作用；(2)bla，編碼β-內(nèi)酰胺酶的氨芐抗性基因；(3)abr，枯草芽孢桿.的抗性選擇基因；(

4、4)一兩段與枯草芽孢桿菌基因組具有一定同源性的序列。20世紀(jì)90年代后，整合載體的研究主要集中于構(gòu)建基因敲除突變體、增大目標(biāo)基因量、染色體步移、融合報告基因等。本實驗重點研究了枯草芽孢桿菌遺傳背景的改造，成功將巰基一二硫鍵氧化還原酶基因整合到枯草芽孢桿菌基因組上。
　　 具體的研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 (1)普魯蘭酶基因amyX的克隆
　　 本研究以Bacillu.licheniformis(ATCC14580

5、)基因組為模板，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(SUBTILIST)已知的序列設(shè)計引物，成功克隆出了普魯蘭酶基因amyX，序列測定結(jié)果與已知序列完全一致。
　　 (2)普魯蘭酶基因amyX在枯草芽孢桿菌野生型菌株B.su.168和改造的菌株WB700中表達(dá)
　　 先將普魯蘭酶基因amyX克隆到含有一個強啟動子的載體pACC上，然后與枯草芽孢桿菌中的質(zhì)粒pUB110連接，最后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，經(jīng)過SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明普魯蘭酶基

6、因amyX在枯草芽孢桿菌野生型菌株B.su.168和改造的菌株WB700中成功表達(dá)。
　　 (3)同源重組整合載體的構(gòu)建
　　 在大腸桿菌高拷貝質(zhì)粒pBluescrip.I.KS(+)的多克隆位點插入了Cm抗性基因cat及其兩端的同向重復(fù)序列FRT，改造好的載體命名為pBSK-p1p4-Cm。
　　 根據(jù)整合到基因組上的目的基因來源，分別構(gòu)建了兩種整合方式的載體，即單交換整合載體和雙交換整合載體。對于枯草芽孢桿菌

7、本身來源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因bdbC，bdbD，直接將其作為同源片斷，由于bdbC，bdbD共用一個啟動子，在基因組上以操縱子的形式存在，因此構(gòu)建的單交換載體命名為pACC-BdbDC。對于大腸桿菌來源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因ds.C，dsbD，dsbE，dsbG，則需要在枯草芽孢桿菌基因組上選擇整合位點，在其整合位點附近各選取500bp基因作為同源片斷，克隆到pBSK-p1p4-Cm上，構(gòu)建了基因敲除載體。再將dsbC，d