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文檔簡(jiǎn)介
1、角蛋白作為羽毛、頭發(fā)和羊毛等的結(jié)構(gòu)蛋白廣泛存在于自然界中,其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,難被白酶蛋解,是角蛋白酶的專一性底物。角蛋白酶由微生物產(chǎn)生,能夠特異性地降解羽毛等角蛋白類的物質(zhì),在飼料、化妝品、醫(yī)藥、添加劑和環(huán)境廢棄物處理等方面具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1(Stenotrophomonasmaltophilia,YHYJ-1)是一株從羽毛處理工廠的污泥中分離到的能降解角蛋白的革蘭氏陰性菌,具有很強(qiáng)的降解羽毛的能力。本實(shí)驗(yàn)采用
2、分子生物學(xué)的方法,對(duì)S.maltophiliaYHYJ-1角蛋白酶基因進(jìn)行克隆表達(dá),并研究角蛋白酶的酶學(xué)性能。具體結(jié)果如下:
野生菌的酶活性質(zhì)分析:以羽毛粉為底物對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí),培養(yǎng)28小時(shí)酶活達(dá)到最高值。粗酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為50℃和9.0,該角蛋白酶在40~45℃保持穩(wěn)定。pH穩(wěn)定性結(jié)果表明,該酶在pH6.6和8.4時(shí)存在兩個(gè)穩(wěn)定峰,說明其為復(fù)合酶。野生菌角蛋白酶對(duì)羽毛、羊毛和頭發(fā)均有不同程
3、度的降解,36小時(shí)能夠?qū)⒂鹈耆到猓瑢?duì)羊毛的降解時(shí)間是72小時(shí),培養(yǎng)84h對(duì)人頭發(fā)有明顯降解作用。
KerF角蛋白酶工程菌的構(gòu)建及酶活性質(zhì)研究:利用分子克隆技術(shù),構(gòu)建了含His標(biāo)簽的pET28-KerF重組表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)中,從誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)溫度兩方面對(duì)目的蛋白的可溶性表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用鎳離子親和柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,得到了單一的角蛋白酶。純化后的角蛋白酶比酶活高達(dá)726U/
4、mg。該角蛋白酶分子量為50kDa,最適溫度50℃,最適pH值9.0。在pH6.6時(shí)酶活性質(zhì)較穩(wěn)定。金屬離子Mn2+、Co2+、Mg2+、Ni+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+及蛋白酶抑制劑二苯基甲基磺酰氟(PFSM)能強(qiáng)烈抑制該酶活性,乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)酶活具有促進(jìn)作用。重組角蛋白酶KerF可判定為堿性絲氨酸蛋白酶。該酶能降解各類蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白、可溶性角蛋白、羽毛粉、羊毛、頭發(fā)等。在與重組角蛋白酶KerF共同培
5、養(yǎng)時(shí),羊毛、頭發(fā)、羽毛粉和牛血清白蛋白底物對(duì)可溶性角蛋白底物(100%)的相對(duì)酶活分別為103.7%、99.3%、76.0%和94.1%。
KerD角蛋白酶工程菌的構(gòu)建及酶活性質(zhì)研究:構(gòu)建pET26-KerD重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)到BL21(DE3)中,表達(dá)得到的KerD角蛋白酶分子量為60kDa,主要以包涵體的形式存在。采用包涵體變性復(fù)性的方法對(duì)其進(jìn)行純化,得到了單一的角蛋白酶,純化后的角蛋白酶比酶活力為26.6U/mg。該角
6、蛋白酶最適溫度為40℃,反應(yīng)最適pH7.8,溫度穩(wěn)定性較差,應(yīng)低溫保存。pH在6.6~7.8之間比較穩(wěn)定。金屬離子Ca2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+能強(qiáng)烈抑制酶活性,蛋白酶抑制劑PFSM對(duì)酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用,可判定角蛋白酶KerD為絲氨酸蛋白酶。1%甲醇、1%異丙醇、5%丙三醇以及5mM的亞硫酸鈉對(duì)酶活促進(jìn)效果明顯;低濃度的L-半胱氨酸和巰基乙醇對(duì)角蛋白酶有激活作用;重組角蛋白酶對(duì)人發(fā)、
7、牛血清白蛋白、羊毛、羽毛等不同結(jié)構(gòu)的角蛋白質(zhì)均具有降解作用,對(duì)可溶性角蛋白的相對(duì)酶活分別為88.9%、92.9%、90.9%和97.8%。
KerF和KerD角蛋白酶性能與已報(bào)道的源于其它種屬的角蛋白酶不同,可判定為新的角蛋白酶。KerF和KerD底物的廣泛性強(qiáng),對(duì)羽毛、羊毛、頭發(fā)等角蛋白質(zhì)均具有較強(qiáng)降解活性,表明其不僅可降解羽毛,用于作為飼料工業(yè)的高效蛋白飼料,而且可以用于紡織工業(yè)蛋白纖維處理等領(lǐng)域,具有良好的應(yīng)用前景。
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