解淀粉芽孢桿菌來源角蛋白酶的高效表達(dá)及羽毛降解工程菌的構(gòu)建.pdf

1、角蛋白酶具有降解角蛋白的能力，在飼料、織物處理、清潔劑、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，能夠產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。本研究旨在篩選獲得快速羽毛降解菌株，解淀粉芽孢桿菌 K11(Bacillus amyloliquefaciens K11），并通過遺傳操作獲得角蛋白酶高效表達(dá)菌株pBSlac-kerK-SCK6和羽毛降解工程菌K1127，為角蛋白酶的工業(yè)應(yīng)用奠定理論及技術(shù)支持。
　　解淀粉芽孢桿菌K11(B. amyloliquef

2、aciens K11)菌株可以利用羽毛作為唯一碳源和氮源，并在24 h內(nèi)將羽毛完全降解。通過SDS-PAGE以及LC-ESI-MS/MS，確定了角蛋白酶的內(nèi)肽序列，進(jìn)一步獲得了其完整的kerK基因序列。利用POE-PCR的方法，成功構(gòu)建了pUB110-kerK表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了其在枯草芽孢桿菌 SCK6中的表達(dá)。通過牛奶平板以及羽毛降解實(shí)驗(yàn)，證明了 kerK基因是羽毛降解的關(guān)鍵基因。角蛋白酶 KerK的酶學(xué)性質(zhì)分析表明：以羽毛粉為底物，

3、其最適 pH為11.0，并且在pH6.0-12.0均具有較好的穩(wěn)定性，最適溫度為50 ℃，熱穩(wěn)定性較好，在50 ℃處理30 min酶活力仍保持在70％。
　　在體外羽毛降解實(shí)驗(yàn)中，純化的角蛋白酶KerK(150 U/ml)在還原劑DTT的共同作用下，50 ℃水浴振蕩反應(yīng)30 min能快速降解完整羽毛。酶解產(chǎn)物分析(HPLC-Chip/ESI-QTOF-MS)表明KerK主要是在絲氨酸和一些疏水性氨基酸間將結(jié)構(gòu)牢固且難以再利用的羽毛

4、降解，產(chǎn)生1-3 kDa富含多種必需氨基酸的可溶性寡肽， VVIQPSPVVVTLPGPILSS， IQPSPVVVTLPGPILSS，和ILSEEGVPISSGGF，為羽毛的循環(huán)利用尤其是作為飼料原料提供了可能性。
　　為了提高角蛋白酶 KerK的表達(dá)量，本研究構(gòu)建了 pBSlac-kerK誘導(dǎo)型表達(dá)載體，并成功的在枯草芽孢桿菌SCK6中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。在15升發(fā)酵罐水平，重組菌最高酶活力可達(dá)3500 U/ml，高于目前報(bào)道的大多數(shù)

5、細(xì)菌來源的角蛋白酶酶活力。同時(shí)，本研究將構(gòu)建的pUB110-kerK表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到原始K11菌株中，構(gòu)建了kerK基因高拷貝的重組K1127菌株，其羽毛降解效率得到進(jìn)一步提高：在12 h內(nèi)能將羽毛幾乎完全降解，且在羽毛培養(yǎng)基中的角蛋白酶活力能達(dá)到1500 U/ml，比原始菌株提高了6倍。高效的羽毛降解能力，使得該重組工程菌在羽毛粉的制備以及廢棄羽毛的處理上具有良好的應(yīng)用前景。
　　綜上所述，本研究通過羽毛降解實(shí)驗(yàn)篩選獲得了快速羽毛