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文檔簡介
1、角蛋白酶(keratinase)是一類可以降解頑固的角蛋白(如羽毛、羊毛、頭發(fā)等)的蛋白酶,廣泛存在于自然界中。角蛋白酶一般可以分類為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。由于角蛋白不能被普通的蛋白酶降解,且數(shù)量巨大,每年都會(huì)有數(shù)百萬噸的含角蛋白廢棄物產(chǎn)生,但是它們并不會(huì)在自然界中堆積,這種要是角蛋白降解微生物產(chǎn)生的角蛋白酶將這些廢棄物分解,從而減輕了環(huán)境的負(fù)擔(dān)。目前,已知細(xì)菌、真菌和放線菌中均有可以產(chǎn)生角蛋白酶的菌株,古細(xì)菌中也有可以產(chǎn)生角蛋白酶
2、的報(bào)道。角蛋白降解微生物可以利用廉價(jià)的角質(zhì)廢棄物作為培養(yǎng)基質(zhì)來產(chǎn)生角蛋白酶,使得角蛋白酶具有較低的生產(chǎn)成本,且角蛋白酶在各種工業(yè)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用,具有很高的利用價(jià)值。
本文在養(yǎng)雞場堆積羽毛的土壤中,分離得到了一株角蛋白降解菌Fea-10。經(jīng)過初步鑒定,F(xiàn)ea-10為微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavus。Fea-10具有很高的角蛋白酶活性,可以完整的降解羽毛。
通過已知的角蛋白酶的N端序列,
3、在Fea-10基因組中找到兩個(gè)可能的角蛋白酶基因gm2886和gm2888。這兩個(gè)基因均由信號(hào)肽、前肽和成熟酶三個(gè)部分構(gòu)成。將這兩個(gè)基因的完整基因分別構(gòu)建在pET15b-SUMO載體上,轉(zhuǎn)入BL21(DE3)均不能表達(dá);更換為pET28a載體和Rossta(DE3)宿主后,只有g(shù)m2888可以獲得無活性的包涵體表達(dá);將這兩個(gè)基因去掉信號(hào)肽的酶原基因分別構(gòu)建在pET22b載體上,轉(zhuǎn)入Rossta(DE3),只有2886可以獲得可溶性表達(dá),
4、但并沒有角蛋白酶活性。
考慮到可能鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)更適于鏈霉菌來源的角蛋白酶表達(dá)并折疊為有活性的成熟酶,使用鏈霉菌-大腸桿菌穿梭整合型質(zhì)粒pSET152進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)宿主菌選擇微弱角蛋白酶活的密旋鏈霉菌ACT12。構(gòu)建gm2886帶有原始啟動(dòng)子和紅霉素啟動(dòng)子的表達(dá)載體和gm2888帶有紅霉素啟動(dòng)子的表達(dá)載體,分別接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入ACT12。使用牛奶平板初篩接合子,并使用TSBY培養(yǎng)基發(fā)酵降解圈大的接合子,使用硫酸銨沉淀后,檢測只有g(shù)
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