馬度米星銨致H9c2心肌細(xì)胞和C2C12骨骼肌細(xì)胞毒性作用機(jī)制研究.pdf

1、為探討馬度米星銨對(duì)心肌和骨骼肌細(xì)胞的毒性作用機(jī)制，本研究采用H9c2和C2C12細(xì)胞作為模型，考察馬度米星銨的毒性，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的影響，探討細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路在馬度米星銨所致細(xì)胞毒性中的作用。具體分為以下幾個(gè)部分:
　　1.馬度米星銨在心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中的毒性作用
　　分別以H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞作為心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞模型，不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12

2、細(xì)胞:0～1μg/mL)處理5天，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，胰酶消化后計(jì)數(shù);不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24、48或72 h，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，馬度米星銨處理5天后，細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，形態(tài)變圓，部分細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞中出現(xiàn)空泡，處理組細(xì)胞數(shù)量明顯少于未處理組，呈濃度依賴(lài)性;馬度米星銨處理24、48

3、或72 h后，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞存活率顯著下降，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)果表明，馬度米星銨抑制H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)，降低細(xì)胞活性，增加細(xì)胞死亡率，馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞具有毒性作用。
　　2.馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響及其機(jī)制
　　不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h或0.5μg/mL馬度米星銨處理不同時(shí)間(H9c2

4、細(xì)胞:0、36、48和72 h，C2C12細(xì)胞:0、24、48和72 h)，PI染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布;不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h，Western blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，不同濃度馬度米星銨處理24 h后，H9c2細(xì)胞G0/G1期比例先升高后降低，S期比例先降低后升高，G2/M期比例逐漸降低;C2C12細(xì)胞G0/G1期比例逐漸升高

5、，S期比例逐漸降低，G2/M期比例逐漸降低;0.5μg/mL馬度米星銨處理不同時(shí)間后，H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞G0/G1期比例逐漸升高，S期比例逐漸降低，G2/M期比例逐漸降低;不同濃度馬度米星銨處理24 h后，H9c2細(xì)胞周期素、CDK6、CDC25B表達(dá)增加;C2C12細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、CDK6和CDC25A表達(dá)量減少，p21Cip1和p27Kip1表達(dá)增加，Rb條帶出現(xiàn)位移、磷酸化水平降低。結(jié)果表明，馬度米星銨

6、對(duì)H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞有明顯的細(xì)胞周期阻滯作用，抑制細(xì)胞增殖。
　　3.馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制
　　不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理72 h，AnnexinⅤ-PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化;不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h，Western blot檢測(cè)

7、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量;z-VAD-fmk預(yù)處理1h后馬度米星銨(0.5μg/mL和1μg/mL)處理24或48 h，Western blot檢測(cè)Cleaved caspase3和Cleaved PARP的表達(dá)情況，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞死亡率的變化情況;不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h，Western blot檢測(cè)AIF蛋白的表達(dá)量，免疫熒光法定位細(xì)胞內(nèi)AIF蛋白。結(jié)果顯示，

8、馬度米星銨處理72 h后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，呈濃度依賴(lài)性;馬度米星銨處理24 h后，H9c2細(xì)胞中TRAIL、DR4、Cleaved caspase8、Cleaved caspase3和Cleaved PARP的表達(dá)水平升高，C2C12細(xì)胞中BAK、BAD、TRAIL、DR4、TRADD、Cleaved caspase9、Cleaved caspase8、Cleaved caspase3和Cleaved PARP蛋白表達(dá)水平升高;z-

9、VAD-fmk預(yù)處理可削弱馬度米星銨導(dǎo)致的Caspase3和PARP蛋白裂解及細(xì)胞死亡;馬度米星銨處理24 h后，H9c2細(xì)胞中AIF表達(dá)增加且更多地轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，C2C12細(xì)胞中AIF表達(dá)量不變但轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中的AIF增多。結(jié)果表明，馬度米星銨能誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致其對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的毒性作用。
　　4.馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞自噬的影響
　　不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:

10、0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量;腺病毒干擾24 h表達(dá)GFP標(biāo)記的LC3蛋白，不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h，熒光顯微鏡下觀察定位細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白。結(jié)果顯示，馬度米星銨處理24 h后，細(xì)胞中LC3Ⅱ和p62蛋白水平升高;腺病毒干擾表達(dá)GFP標(biāo)記的LC3蛋白，馬度米星銨處理24 h后，熒光

11、顯微鏡下觀察，藥物處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)有大量綠色熒光點(diǎn)，表明LC3蛋白聚集。結(jié)果表明，馬度米星銨能誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞自噬并阻斷自噬流。
　　5.馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞MAPK通路蛋白和蛋白磷酸酶的影響
　　不同濃度馬度米星銨(0～1μg/mL)處理H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白和蛋白磷酸酶的表達(dá)量;腺病毒干擾表達(dá)MKK1-R4F和顯性失活P

12、P2A，0.5μg/mL和1μg/mL馬度米星銨處理H9c2細(xì)胞24 h或48 h，Westernblot檢測(cè)p-ERK蛋白的表達(dá)量，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性;PP2A抑制劑Okadaic acid預(yù)處理1h，0.5μg/mL和1μg/mL馬度米星銨處理H9c2細(xì)胞48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性;腺病毒干擾表達(dá)顯性失活c-Jun，0.5μ

13、g/mL和1μg/mL馬度米星銨處理C2C12細(xì)胞24 h或48 h，Western blot檢測(cè)c-Jun蛋白的表達(dá)量，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性;腺病毒干擾過(guò)表達(dá)PP5，0.5μg/mL和1μg/mL馬度米星銨處理C2C12細(xì)胞24 h或48 h，Westem blot檢測(cè)p-JNK和p-c-Jun蛋白的表達(dá)量，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性;J

14、NK抑制劑SP600125預(yù)處理1h，0.5μg/mL和1μg/mL馬度米星銨處理C2C12細(xì)胞48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，馬度米星銨處理24 h后，H9c2細(xì)胞中p-ERK、p-PP2A和demethylated PP2A(De-PP2A)蛋白水平降低，methylated PP2A(Me-PP2A)表達(dá)量升高;C2C12細(xì)胞中p-JNK和p-c-Jun蛋白水平升高，P

15、P5蛋白水平降低。H9c2細(xì)胞中腺病毒干擾表達(dá)MKK1-R4F和顯性失活PP2A可削弱馬度米星銨對(duì)ERK蛋白磷酸化的抑制及細(xì)胞毒性;Okadaicacid預(yù)處理可削弱馬度米星銨細(xì)胞毒性。C2C12細(xì)胞中腺病毒干擾表達(dá)顯性失活c-Jun可削弱馬度米星銨細(xì)胞毒性;過(guò)表達(dá)PP5可削弱馬度米星銨對(duì)JNK和c-Jun蛋白磷酸化的激活及細(xì)胞毒性;SP600125預(yù)處理可削弱馬度米星銨細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，馬度米星銨增強(qiáng)H9c2細(xì)胞PP2A活性，引起E

16、RK蛋白磷酸化水平降低，導(dǎo)致其對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用;馬度米星銨抑制C2C12細(xì)胞PP5蛋白表達(dá)，使JNK和c-Jun磷酸化水平升高，導(dǎo)致其對(duì)骨骼肌細(xì)胞的毒性作用。
　　6.馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞Akt1-FoxO3a通路的影響
　　不同濃度馬度米星銨處理H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)Akt1、p-Akt1(S473)、p-Akt1(T308)、FoxO3a-和p-FoxO3a(T

17、hr132)蛋白的表達(dá)量，免疫熒光定位細(xì)胞內(nèi)FoxO3a蛋白;腺病毒干擾表達(dá)持續(xù)激活A(yù)kt，0.5μg/mL和1μg/mL馬度米星銨處理細(xì)胞24 h或48 h，Western blot檢測(cè)p-FoxO3a(Thr132)蛋白的表達(dá)量，免疫熒光定位細(xì)胞內(nèi)FoxO3a蛋白，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，馬度米星銨處理24 h后，細(xì)胞中p-Akt1(S473)、p-Akt1(T308)和p

18、-FoxO3a(Thr132)蛋白水平降低，細(xì)胞核中FoxO3a含量增加。腺病毒干擾表達(dá)持續(xù)激活A(yù)kt可削弱馬度米星銨對(duì)FoxO3a蛋白磷酸化和胞漿轉(zhuǎn)移的抑制及細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，馬度米星銨抑制H9c2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中Akt1活性，導(dǎo)致FoxO3a蛋白磷酸化水平降低，抑制其胞漿轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致其對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的毒性作用。
　　7.馬度米星銨對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞AMPK蛋白的影響
　　不同濃度馬度米星銨(H9c2

19、細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24 h，Westem blot檢測(cè)AMPK和p-AMPK(Thr172)蛋白的表達(dá)量;腺病毒干擾表達(dá)顯性失活A(yù)MPK，0.5μg/mL和1μg/mL馬度米星銨處理細(xì)胞24 h或48 h，Westernblot檢測(cè)AMPK蛋白的表達(dá)量，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性;AMPK抑制劑Compound C預(yù)處理1h，0.5μg/mL和1μ

20、g/mL馬度米星銨處理細(xì)胞48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照，One solution法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，馬度米星銨處理24 h后，細(xì)胞中p-AMPK(Thr172)蛋白水平升高;腺病毒干擾表達(dá)顯性失活A(yù)MPK和Compound C預(yù)處理可削弱馬度米星銨細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，馬度米星銨增加細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平，從而導(dǎo)致其對(duì)心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的毒性作用。
　　8.馬度米星銨致心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

21、激
　　不同濃度馬度米星銨(H9c2細(xì)胞:0～5μg/mL，C2C12細(xì)胞:0～1μg/mL)處理24或48 h，利用CM-H2DCFDA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，Western blot檢測(cè)PERK、p-PERK(Thr980)、eIF2α、p-eIF2α(Ser51)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，馬度米星銨處理24或48 h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高;馬度米星銨處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)PERK和eIF2α蛋白磷酸化水平升高，呈濃度依賴(lài)性。結(jié)