環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病原的研究.pdf

1、隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，水產(chǎn)動(dòng)物的病害越發(fā)嚴(yán)重，成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一。水產(chǎn)病原的快速診斷，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的良種選育，疾病預(yù)防、進(jìn)出口檢疫、水產(chǎn)品食品安全等方面具有重大意義。由于各自的缺陷，常規(guī)的病原檢測(cè)技術(shù)大都不適合養(yǎng)殖基層的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是一種新的DNA擴(kuò)增方法。該技術(shù)依賴(lài)于自動(dòng)循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，通

2、過(guò)識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和具有鏈置換的DNA聚合酶，在等溫條件下，不到1h就能擴(kuò)增出109靶序列拷貝，具有特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適合于養(yǎng)殖基層的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
　　 本研究新建了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法分別快速檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合征病毒、皮下及造血組織壞死病毒和弧菌。首次進(jìn)行了白斑綜合征病毒和皮下及造血組織壞死病毒進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的研究，以及首次對(duì)某一類(lèi)特定病原體進(jìn)行通用LAMP檢測(cè)研究，研究了LAMP對(duì)弧菌屬細(xì)菌的通用性檢測(cè)

3、。設(shè)計(jì)不同病原相應(yīng)的檢測(cè)引物，分別對(duì)其反應(yīng)條件（鎂離子濃度、甜菜堿濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等）進(jìn)行了優(yōu)化，并檢測(cè)了其特異性及靈敏度。首次將dUTP-UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）技術(shù)引入LAMP檢測(cè)中，克服了LAMP反應(yīng)極易產(chǎn)生假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，并對(duì)dUTP對(duì)dTTP的替代率、替代對(duì)反應(yīng)靈敏度的影響進(jìn)行了研究。并將建立好的LAMP檢測(cè)方法用于實(shí)際水產(chǎn)動(dòng)物樣品的病原檢測(cè)。具體結(jié)論如下:
　　 1、優(yōu)化后的白斑綜合征病毒LAMP反應(yīng)體

4、系在64℃下45 min即能有理想擴(kuò)增效果。加入SYBR GreenⅠ后，能用肉眼進(jìn)行結(jié)果的判斷。使用常見(jiàn)細(xì)菌和對(duì)蝦病毒做對(duì)照，顯示LAMP反應(yīng)對(duì)WSSV檢測(cè)具有很好的特異性。靈敏度達(dá)到100 copies/μl，比巢式PCR高100倍。反應(yīng)中使用dUTP替代部分dTTP，結(jié)合UNG酶，可以避免LAMP的產(chǎn)物遺留污染的問(wèn)題，但替代率高于50％后，顯著抑制反應(yīng)的擴(kuò)增效率。在對(duì)蝦樣品的WSSV檢測(cè)中，LAMP方法表現(xiàn)出比巢式PCR更好的檢測(cè)

5、靈敏度和更快速的檢測(cè)流程。
　　 2、皮下及造血組織壞死病毒LAMP反應(yīng)體系在65℃反應(yīng)60 min完成擴(kuò)增反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)熒光染色后發(fā)生顏色變化，產(chǎn)物檢測(cè)方便。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切得到與預(yù)期相吻合的片段。50％的dUTP替代和UNG酶的使用能避免假陽(yáng)性的發(fā)生，但會(huì)使反應(yīng)靈敏度下降10倍。LAMP反應(yīng)對(duì)IHHNV具有較好的特異性。其LAMP靈敏度較普通PCR高1000倍。對(duì)實(shí)際對(duì)蝦樣品的IHHNV檢測(cè)中，LAMP方法于PCR方法結(jié)果一

6、致，但表現(xiàn)出更高的效率和更加直觀準(zhǔn)確的結(jié)果。
　　 3、優(yōu)化后的WSSV和IHHNV多重LAMP反應(yīng)體系需在65℃反應(yīng)60 min。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶切得到的與預(yù)期大小相吻合的條帶。多重LAMP具有較好的特異性和較高的靈敏度，比巢式PCR高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較普通PCR高三個(gè)數(shù)量級(jí)。在實(shí)際對(duì)蝦樣品的檢測(cè)中，多重LAMP檢測(cè)較PCR檢測(cè)具有更高的病毒檢出率和更高的檢測(cè)效率。
　　 4、優(yōu)化后的弧菌屬細(xì)菌通用LAMP檢測(cè)的反應(yīng)體系需在62