環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測沙門菌和志賀菌的研究.pdf

1、微生物污染是影響食品衛(wèi)生和安全的主要因素之一，其中細(xì)菌性食物中毒導(dǎo)致的中毒人數(shù)最多?？焖贆z測食品中病原細(xì)菌是及時(shí)有效預(yù)防病原細(xì)菌傳播及食物中毒的重要前提。目前病原細(xì)菌的檢測主要依靠常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法，一般需4d～7d，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用4條特異的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速

2、地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。該技術(shù)在1h內(nèi)能擴(kuò)增出109靶序列拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。LAMP技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。
　　 本研究針對己報(bào)道的沙門菌保守的invA基因和志賀菌ipaH基因設(shè)計(jì)了2套特異性的引物，利

3、用LAMP技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA，建立了沙門菌和志賀菌的快速LAMP檢測技術(shù)，并初步應(yīng)用于人為污染病原細(xì)菌的牛奶樣品的檢測中，主要研究結(jié)果如下。
　　 1沙門菌和志賀菌LAMP引物設(shè)計(jì)及特異性分析
　　 (1)根據(jù)沙門菌invA基因和志賀菌ipaH基因序列，應(yīng)用PrimerExplorer5.0設(shè)計(jì)引物并通過Oligo6.0進(jìn)行分析，確保引物之間無二聚體形成，同時(shí)應(yīng)用BLAST程序，通過GeneBank對各引物及擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)

4、行同源性對比，獲得兩組特異性引物：
　　 invA-F3:5'-GCGATAATATGGGGCGGAAT;
　　 invA-B3:5'-CGCCTTTGCTGGTTTTAGGT;
　　 invA-FIP:5'-TCCCGGCAGAGTTCCCATTGAAATCATGACGCAGCTGTTGAA;
　　 invA-BIP:5'-TTCCCGCTGCCGGTATTTGTTGCTACGTTTTGCTTCACGG

5、A;
　　 invA-LB:5'-GCCGTAACAACCAATACAAATGG;
　　 invA-LF:5'-TATTCGGTGGTTTTAAGCGTACTC;
　　 ipaH-F3:5'-GCCTTTCCGATACCGTCTCT;
　　 ipaH-B3:5'-TGATGGACCAGGAGGGTT;
　　 ipaH-FIP:5'-TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACC

6、TCCGGATTC;
　　 ipaH-BIP:5'-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA;
　　 ipaH-LB:5'-TGCAGCGACCTGTTCACG;
　　 ipaH-LF:5'-CTGCTGATGCCACTGAGAGC;
　　 (2)優(yōu)化了沙門菌LAMP反應(yīng)條件，并對引物的特異性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明沙門菌最佳反應(yīng)條件為：外引物invA-F3和inv

7、A-B3濃度為5pmol/L，內(nèi)引物invA-FIP和invA-BIP濃度為40pmol/L，環(huán)引物invA-LB和invA-LF濃度為20pmol/L。Mg2+濃度為6mmol/L，dNTP濃度為0.8mmol/L;63℃保溫45min，80℃加熱2min。引物的特異性實(shí)驗(yàn)表明，沙門菌引物能擴(kuò)增供試的沙門菌，而對其它菌均為陰性，表明其特異性好。在此條件下LAMP對沙門菌DNA的檢出限為10fg/反應(yīng)。
　　 (3)研究了志賀菌

8、LAMP反應(yīng)的最佳條件，并對其引物的特異性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明志賀菌最佳反應(yīng)條件為：外引物ipaH-F3和ipaH-B3濃度為5pmol/L，內(nèi)引物ipaH-FIP和ipaH-BIP濃度為40pmol/L，環(huán)引物ipaH-LB和ipaH-LF濃度為20pmol/L，Mg2+濃度為8mmol/L，dNTP濃度為1.0mmol/L，反應(yīng)溫度63℃，時(shí)間45min。引物的特異性實(shí)驗(yàn)表明，志賀菌引物均能擴(kuò)增供試的志賀菌，而對其它菌均為陰性，表明

9、其引物的特異性良好。在此條件下LAMP對志賀菌DNA的檢出限為1fg/反應(yīng)。
　　 2沙門菌和志賀菌的雙重LAMP檢測方法的建立
　　 經(jīng)過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了沙門菌和志賀菌的雙重LAMP最佳反應(yīng)條件為：外引物invA-F3和invA-B3濃度為5pmol/L，外引物ipaH-F3和ipaH-B3濃度為5pmol/L，內(nèi)引物invA-FIP和invA-BIP濃度為40pmol/L，內(nèi)引物ipaH-FIP和ipaH-BIP濃度為

10、40pmol/L，環(huán)引物invA-LB和invA-LF濃度為20pmol/L，環(huán)引物ipaH-LB和ipaH-LF濃度為20pmol/L:Mg2+濃度為8mmol/L，dNTP濃度為1.0mmol/L，BstDNA聚合酶8U。反應(yīng)條件為63℃溫浴60min;80℃加熱2min終止反應(yīng)。
　　 在此條件下雙重LAMP同時(shí)檢測沙門菌和志賀菌DNA的敏感性為10fg/反應(yīng)。但是PCR的敏感性只能達(dá)到1pg/反應(yīng)。對人為污染沙門菌和志賀