抑制體外擴(kuò)增小鼠造血干細(xì)胞衰老維持干性-下調(diào)異常激活的mTORC1信號(hào).pdf

1、第一部分mTORC1在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中的活化規(guī)律
　　 目的：mTORC1 掌控了細(xì)胞多種生命過程，研究表明過高的mTORC1 活性會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)壞境平衡。本研究的目的是探討造血干細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中，胞內(nèi)的mTORC1 活性的變化規(guī)律。
　　 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細(xì)胞，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞，應(yīng)用Rapamycin 作為mTORC1 抑制劑，以DMSO 作為

2、對(duì)照。擴(kuò)增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴(kuò)增后細(xì)胞，流式檢測(cè)胞內(nèi)mTORC1 底物p70 s6k 磷酸化狀況。
　　 結(jié)果：Lin-Sca-1+細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下開始增殖，第6天時(shí)細(xì)胞擴(kuò)增了25±4.5倍，到了第10天時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)增了82±5.2 倍。磷酸化p70 s6k的表達(dá)與之相應(yīng)。在未擴(kuò)增初始的狀態(tài)下，只有5.82±3.12％的細(xì)胞表達(dá)磷酸化p70 s6k，擴(kuò)增了6天以后，22.4±

3、4.67％的細(xì)胞表達(dá)磷酸化p70 s6k，而擴(kuò)增了10天以后，73.4±5.23％的細(xì)胞表達(dá)磷酸化p70 s6k；在第6天的時(shí)候加入Rapamycin 可以有效的抑制磷酸化p70s6k的表達(dá)，但是并沒有完全抑制磷酸化p70 s6k的表達(dá)。
　　 結(jié)論：mTORC1在10天的小鼠造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程當(dāng)中，前6天呈現(xiàn)一定水平的激活，在擴(kuò)增的第7-10天呈現(xiàn)一個(gè)劇烈激活的過程，這個(gè)過程和總細(xì)胞的大量擴(kuò)增相呼應(yīng)。
　　 第二部

4、分抑制mTORC1 異?；钚源龠M(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增以及干性維持
　　 目的：mTORC1 過高活性會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞池的耗竭，而Rapamycin 為m TORC1 有效抑制劑。在上一部分的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mTORC1在擴(kuò)增7-10天出現(xiàn)劇烈激活過程，本部分研究目的就是利用Rapamycin 抑制mTORC1在小鼠造血干細(xì)胞擴(kuò)增第7-10天呈現(xiàn)的劇烈激活，研究其能否進(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增以及干性維持。
　　 方法：分選小鼠骨髓

5、Lin-Sca-1+細(xì)胞，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞，應(yīng)用Rapamycin 作為mTORC1 抑制劑，以DMSO 作為對(duì)照。擴(kuò)增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴(kuò)增后細(xì)胞。利用流式檢測(cè)細(xì)胞的表型，利用CAFCs（Cobblestone Area-Forming Cells）法檢測(cè)體外造血干細(xì)胞的功能，利用競(jìng)爭性移植的辦法檢測(cè)造血干細(xì)胞長期造血能力。
　　 結(jié)

6、果：Rapamycin在第6天加入，在擴(kuò)增結(jié)束以后，會(huì)略微的減少有核細(xì)胞總的數(shù)量，Veh組總的有核細(xì)胞數(shù)量為2.73±0.33×105，而加Rapamycin組總的有核細(xì)胞數(shù)量為2.43±0.21×105。但是Rapamycin的加入?yún)s增高了LSK+細(xì)胞和Lin-Sca-1+細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例，通過計(jì)算得出總的LSK+細(xì)胞和Lin-Sca-1+細(xì)胞的數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)，Rapamycin 相較于Veh可以顯著的增加LSK+細(xì)胞和Lin-S

7、ca-1+細(xì)胞的數(shù)量，Veh組分別得到1.27±0.47×104和7.34±3.0×103的Lin-Sca-1+細(xì)胞和LSK+細(xì)胞，而Rapamycin組則得到1.97±0.56×104和10.64±3.42×103的Lin-Sca-1+細(xì)胞和LSK+細(xì)胞。當(dāng)與初始的Lin-Sca-1+細(xì)胞比較，計(jì)算Lin-Sca-1+細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)時(shí)，Veh組獲得了4.2倍的擴(kuò)增，而Rapamycin 獲得了6.5倍的擴(kuò)增。Rapamycin 相較于

8、Veh獲得了1.5倍的Lin-Sca-1+細(xì)胞數(shù)量。Rapamycin 可以明顯的增加day14-CAFCs和day35-CAFCs，可以獲得150.67±16.4和9.26±1.45/100，000細(xì)胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs，而Veh則只能獲得97.3±7.6和3.53±1.02/100，000細(xì)胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs。當(dāng)計(jì)算day35-CAFCs擴(kuò)增倍數(shù)時(shí)，即相當(dāng)于計(jì)算體外造血干

9、細(xì)胞功能時(shí)，Veh獲得了0.73±0.08倍的擴(kuò)增，而Rapamycin 獲得了1.95±0.25倍的擴(kuò)增。Rapamycin 擴(kuò)增后的細(xì)胞相較于Veh擴(kuò)增后的細(xì)胞在第8周的時(shí)候，能更有效的植入照射模型的小鼠體內(nèi)Rapamycin組CD45.2細(xì)胞的植入率為32.23±10.7％，Veh組的植入率為18.16±9.32％；隨著時(shí)間的延長至32周，Veh組的植入率有所降低，9.93±8.25％，而Rapamycin組的植入率為42.1±1

10、1.2％。
　　 結(jié)論：Rapamycin 能夠促進(jìn)體外造血干細(xì)胞的擴(kuò)增，并且增強(qiáng)擴(kuò)增后細(xì)胞造血重建的速度和長期造血重建功能，維持其干性。
　　 第三部分抑制mTORC1 異?；钚源龠M(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的機(jī)制探討
　　 目的：雖然明確了抑制mTORC1異?；钚钥梢源龠M(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增以及干性維持，但是其機(jī)制尚不清楚。在其他細(xì)胞環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)mTORC1活性與干細(xì)胞的凋亡，分化，衰老密切相關(guān)，本研究的目的是探討抑

11、制mTORC1活性促進(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增及干性維持的機(jī)制。
　　 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細(xì)胞，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞，應(yīng)用Rapamycin 作為mTORC1抑制劑，以DMSO作為對(duì)照。擴(kuò)增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴(kuò)增后細(xì)胞。利用流式，免疫熒光，細(xì)胞組織化學(xué)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)細(xì)胞的周期，衰老等相關(guān)分子表達(dá)。
　　 結(jié)果：通

12、過Annexin-V對(duì)凋亡細(xì)胞的標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)Veh組的總細(xì)胞Annexin-V表達(dá)率為8.93±1.5％，Rapamycin組的總細(xì)胞Annexin-V表達(dá)率為11.79±3.7％；在LSK+的細(xì)胞群體當(dāng)中，Annexin-V表達(dá)率在Veh組和Rapamycin組分別為2.61±0.57％和2±0.22％。通過CFCs（cloning forming cells）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rapamycin 對(duì)于粒-巨細(xì)胞形成集落，爆式紅細(xì)胞集落的生成沒有

13、顯著的影響。對(duì)衰老表型的研究發(fā)現(xiàn)，在未擴(kuò)增的對(duì)照的細(xì)胞中，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)衰老的細(xì)胞，細(xì)胞在Veh的處理下，擴(kuò)增了10天以后，Lin-Sca-1+細(xì)胞出現(xiàn)了9.7±1.95％的衰老細(xì)胞，但是Rapamycin 非常明顯的抑制了衰老細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，為2.4±0.71％。對(duì)自噬的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Rapamycin 處理以后，自噬標(biāo)志性分子LC3b的表達(dá)面積顯著低于Veh組，甚至比未擴(kuò)增的細(xì)胞還要低；對(duì)細(xì)胞周期的研究發(fā)現(xiàn)，Rapamycin 處理顯

14、著的增加了G0期細(xì)胞的比例，Veh組的G0期細(xì)胞的比例為11.75±3.3％，Rapamycin組的G0期細(xì)胞的比例為21.7±3.5％。不僅如此，Rapamycin的處理還減低了p16和p53的表達(dá)。
　　 結(jié)論：抑制mTORC1活性并沒有影響造血干細(xì)胞的凋亡和分化，而顯著降低了其在擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的衰老。Rapamycin 并沒有通過增強(qiáng)自噬來抑制衰老，而是通過調(diào)節(jié)了一系列的細(xì)胞周期動(dòng)力因子和阻滯因子實(shí)現(xiàn)了對(duì)衰老的抑制。

15、>　　 第四部分mTORC1和p38 MAPKα在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中的相互對(duì)話關(guān)系
　　 目的：在以前的研究中發(fā)現(xiàn)了抑制p38 MAPKα的活性可以通過抑制衰老促進(jìn)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，而在這里發(fā)現(xiàn)了抑制mTORC1的活性也是主要通過抑制衰老的作用而促進(jìn)了造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，那么兩者的關(guān)系究竟如何呢？在這部分的研究當(dāng)中對(duì)mTORC1和p38 MAPKα相互對(duì)話關(guān)系進(jìn)行了深入的探討和研究。
　　 方法：分選小鼠骨

16、髓Lin-Sca-1+細(xì)胞，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞，應(yīng)用Rapamycin 作為mTORC1 抑制劑，SB(SB203580)作為p38 MAPKα的抑制劑，以DMSO 作為對(duì)照。擴(kuò)增10天，SB 從第一天開始加，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴(kuò)增后細(xì)胞。通過免疫印跡，免疫熒光，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程當(dāng)中

17、，抑制mTORC1 對(duì)p38 MAPKα沒有影響，但是抑制p38 MAPKα活性會(huì)反而增強(qiáng)mTORC1的活性。聯(lián)合抑制mTORC1和p38 MAPKα可以進(jìn)一步促進(jìn)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。四組比較發(fā)現(xiàn)，Veh組獲得了1.5±0.3×103，Rapamycin組獲得了1.9±0.1×103，SB組獲得了2.2±0.2×103，聯(lián)合處理組獲得了2.6±0.14×103的LSK+細(xì)胞，以及更多的day35CAFCs，分別為3.4±0.57，7.

18、8±0.32，9.7±0.21，11.4±0.63/100，000個(gè)擴(kuò)增細(xì)胞。聯(lián)合抑制mTORC1和p38 MAPKα，通過對(duì)SA-β-gal的研究發(fā)現(xiàn)SB和Rapamycin的聯(lián)合應(yīng)用明顯的進(jìn)一步降低了衰老表型的表達(dá)，只有1.9±0.7％，而單獨(dú)加入Rapamycin或者SB 則有4.3±2.1％，5.2±1.6％，聯(lián)合抑制以后p16和p53的表達(dá)進(jìn)一步降低，只有Veh組的0.37±0.05，0.45±0.08 倍。
　　 結(jié)