用于人造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的小分子化合物篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 用于小分子化合物篩選的單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)體系建立
　　造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是目前研究最為深入的一類(lèi)干細(xì)胞，它具有自我更新及多向分化兩大重要特點(diǎn)，能夠在保持干細(xì)胞池相對(duì)穩(wěn)定的同時(shí)增殖分化為復(fù)雜造血系統(tǒng)中的各系血細(xì)胞。然而，HSCs在骨髓及臍帶血中比例極低，基礎(chǔ)研究及臨床移植中用到的HSCs又多為異質(zhì)性的細(xì)胞群體，即HSCs及定向

2、分化的造血祖細(xì)胞混合體，雖然臍帶血的應(yīng)用大大降低了臨床用造血干細(xì)胞對(duì)組織相容性抗原(HLA)的要求，但臍帶血仍無(wú)法滿(mǎn)足成人移植所需的造血干細(xì)胞量?；诖耍R床移植面臨HSCs數(shù)目不足及移植用HSCs無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題亟待解決。小分子化合物在HSCs調(diào)控領(lǐng)域以其濃度可精確調(diào)控、結(jié)構(gòu)多樣方便優(yōu)化、易于處理等特點(diǎn)顯示出極大優(yōu)勢(shì)，已有研究證實(shí)，SR1及UM71兩種小分子化合物單獨(dú)使用及組合使用均可顯著擴(kuò)增HSPCs(hematopoieti

3、c stem/progenitorcells)，其擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)到100倍以上。近年興起的單細(xì)胞技術(shù)，可有效解決細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題，細(xì)胞表面標(biāo)記研究結(jié)合先進(jìn)的流式細(xì)胞分選平臺(tái)，使得純化獲取單個(gè)hHSC成為可能。已有研究表明，造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記除了經(jīng)典的CD34、CD38外，CD90、CD45RA以及HSCs特異性標(biāo)記CD49f,的表面標(biāo)記組合可將HSCs與造血祖細(xì)胞充分區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而獲得單純的HSCs。體外造血功能實(shí)驗(yàn)CFC(colonyf

4、orming cells)及CAFC(cobblestone area forming cells)可用于體外驗(yàn)證HSCs功能，其中CFC側(cè)重于觀測(cè)多能祖細(xì)胞的分化能力，CAFC可反映培養(yǎng)系統(tǒng)中具有長(zhǎng)期造血重建能力的HSCs。
　　目的:本研究主要通過(guò)利用對(duì)HSCs有明顯擴(kuò)增作用的小分子化合物SR1及UM171，構(gòu)建多參數(shù)單細(xì)胞的流式分選及培養(yǎng)體系，通過(guò)對(duì)分選得到的單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)后流式檢測(cè)及形態(tài)分析，以及體外造血功能實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)

5、證本單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性和可靠性，以便用于后續(xù)調(diào)控HSCs功能的小分子化合物篩選。
　　方法:首先，通過(guò)CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)確定SR1及UM171的使用濃度，再通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索得到單細(xì)胞培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基體系，利用BD INFLUX流式分選儀將單個(gè)DAPI-CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+細(xì)胞分選到96孔板中進(jìn)行14d體外培養(yǎng)，并完成培養(yǎng)后流式分析及細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)，分析單個(gè)hHSC培養(yǎng)體系中小分子化

6、合物的作用。利用經(jīng)典的體外造血功能實(shí)驗(yàn)作一對(duì)比，以此驗(yàn)證體系的穩(wěn)定性。
　　結(jié)果: CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)確定了化合物使用濃度為SR1(1μmol/L)，UM171(35nmol/L)，SR1+UM171(750nmol/L+35nmol/L)。單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)14天流式結(jié)果顯示，化合物處理組較對(duì)照組相比，有效孔數(shù)明顯增加，在各孔細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯差異的情況下，化合物處理組CD34+細(xì)胞及CD34+CD49f+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)及比例顯著

7、增高（P＜0.05），幾乎所有有效孔細(xì)胞均向髓系、淋系兩大方向分化，未出現(xiàn)偏系分化，細(xì)胞染色結(jié)果與流式檢測(cè)結(jié)果一致。CFC結(jié)果顯示，處理組克隆總數(shù)及各種克隆數(shù)目較對(duì)照組顯著增加，且克隆形態(tài)及各種克隆比例無(wú)差異。CAFC泊松分布結(jié)果表明，處理組HSCs頻率較對(duì)照組明顯上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論:此構(gòu)建的單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)體系可保證SR1及UM171處理?xiàng)l件下，HSC保持自我更新同時(shí)仍具有多向分化潛能，縮短了體外擴(kuò)增及驗(yàn)證性實(shí)

8、驗(yàn)周期，初步解決了HSCs研究面臨的異質(zhì)性問(wèn)題，為之后篩選靶向HSC的小分子化合物奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 化小分子化合物用于hHSCs體外擴(kuò)增的研究
　　HSCs在早期發(fā)育及生命過(guò)程中，發(fā)揮著維持組織穩(wěn)態(tài)等生理學(xué)功能。其自我更新及多向分化兩大特性之間的平衡，對(duì)于HSCs的功能起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)對(duì)于胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，這一平衡可以由活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)

9、來(lái)調(diào)節(jié)，ROS可以改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)代謝的同步性。但是，研究證實(shí)，HSCs在低氧環(huán)境生存，較低的ROS水平可以幫助維持長(zhǎng)期HSCs的生物學(xué)功能，提高移植成功率。HSCT不僅需要保證細(xì)胞的功能，還需要有用于移植的足夠數(shù)量的細(xì)胞，這也是急需解決的一個(gè)問(wèn)題。人體的抗氧化防御系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，它能夠維持較低的ROS水平，同時(shí)確保機(jī)體內(nèi)的ROS作為第二信使行使信號(hào)傳導(dǎo)功能，此系統(tǒng)如不能完成恰當(dāng)?shù)难趸€原調(diào)控，可能會(huì)造成ROS水平升

10、高導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，需要有外界抗氧化物介入調(diào)節(jié)。
　　目的:通過(guò)對(duì)抗氧化小分子化合物庫(kù)中的85種小分子化合物進(jìn)行篩選，得到對(duì)HSCs有明顯體外擴(kuò)增作用的幾種小分子化合物，并初步驗(yàn)證其對(duì)HSCs生物學(xué)功能的影響，進(jìn)而研究其抗氧化作用機(jī)制。
　　方法:首先由于小分子化合物庫(kù)中的抗氧化物在HSCs領(lǐng)域未有報(bào)道，需要利用CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法，確定化合物的使用濃度，經(jīng)過(guò)初篩以及設(shè)計(jì)化合物濃度梯度，體外培養(yǎng)后流式分析CD34+細(xì)

11、胞及CD34+CD49f+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)及比例，得到合適的化合物濃度。通過(guò)體外造血功能實(shí)驗(yàn)CFC(細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)，colonyforming cell assay)驗(yàn)證其對(duì)HSCs自我更新及多向分化兩大方面的影響。
　　結(jié)果:初步篩選85種抗氧化小分子化合物得到對(duì)CD34+細(xì)胞以及CD34+CD49f+細(xì)胞均有顯著作用(P＜0.05)的9種化合物，分別為C2968(5μM)、B1753(20μM)、B3358(10μM)、C0168

12、(10μM)、D3331（5μM）、B8071（20μM）、B8174(10μM)、C0263(20μM)、C2943（10μM）。綜合化合物濃度及擴(kuò)增效果兩方面因素選取C2968(5μM)、B1753（20μM）、B3358(10μM)、C0168（10μM）、D3331(5μM)五種小分子化合物進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定使用濃度。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)CFC結(jié)果顯示化合物C2968(0.5μM)、B1753（1.5μM）、B3358（15μM

13、）、D3331(1.5μM)處理組較對(duì)照組而言，細(xì)胞的集落形成能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05），化合物處理可維持各類(lèi)血細(xì)胞的祖細(xì)胞多向分化潛能，特別是多能祖細(xì)胞的造血能力。
　　結(jié)論:抗氧化小分子化合物C2968(0.5μM)、B1753（1.5μM）、B3358(15μM)、D3331(1.5μM)具有較好的HSCs體外擴(kuò)增效果，在維持HSCs自我更新的同時(shí)能夠保證其多向分化潛能不受影響。C2968（0.5μM）、B1753（1.5