抑制P38MAPK、mTORC1和AHR信號促進人臍帶血HSCs擴增并維持干性.pdf

1、第一部分抑制臍帶血CD34+細胞體外擴增過程中P38 MAPK和mTORC1信號降低細胞衰老水平
　　背景：造血干細胞移植（HSCT）是一種有效的治療造血系統(tǒng)疾病的方法。但由于造血干細胞（HSCs）數(shù)量不足，嚴重阻礙了 HSCT在臨床中的應(yīng)用。盡管臨床上對臍帶血HSCT的研究表明，臍帶血HSCs在體外擴增兩倍即可滿足臨床治療的需求，但問題是傳統(tǒng)利用組合細胞因子或飼養(yǎng)層細胞擴增HSCs的方法很難得到具有長期造血重建能力的HSCs。造

2、血重建能力是衡量 HSCs在植入受者體內(nèi)后重建骨髓造血情況的指標。因此，在擴增HSCs的同時維持干細胞的自我更新、多譜系分化、相對靜止等干細胞性質(zhì)，即維持干細胞的干性（stemness）成為人們關(guān)注的焦點。
　　HSCs的發(fā)育經(jīng)歷增殖、分化、衰老，最終走向死亡，因此可以通過調(diào)控 HSCs的增殖、分化、衰老以及死亡過程從而達到促進其在體外擴增的目的。β-半乳糖苷酶是衰老細胞的一種生物學(xué)標志，其在細胞中活性增高意味著細胞衰老發(fā)生。衰老

3、的HSC雖具有代謝活性，但喪失了干細胞的自我更新和多系分化潛能。我們之前的研究表明，抑制過度活化的P38 MAPK或mTORC1信號可以降低擴增后細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性，通過抑制細胞衰老促進HSCs在體外擴增，并增強擴增后細胞的造血重建能力。鑒于抑制活化的P38 MAPK或mTORC1信號均可以抑制細胞衰老，我們期望同時抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號能進一步抑制細胞衰老，促進HSCs在體外擴增，同時增加HSCs的造血重

4、建能力。
　　方法：我們?nèi)〗】诞a(chǎn)婦的臍帶靜脈血，利用磁珠分選的方法分離臍帶血CD34+細胞。利用細胞因子IL-6、TPO、SCF和Flt3-Ligand擴增臍帶血CD34+細胞，同時利用LY2228820和（或）Rapamycin抑制細胞體外擴增過程中活化的P38 MAPK和（或）mTORC1信號。在擴增后，我們利用western blot或流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)P38 MAPK和mTORC1信號通路中重要的信號分子p-P38、p-

5、P70 S6、p-4E BP1或 p-mTOR的表達。利用流式細胞術(shù)檢測擴增后細胞表面 CD34、CD38、CD90、CD45RA分子的表達。同時利用流式細胞術(shù)檢測了細胞增殖、周期、凋亡和衰老情況。另外，我們還通過克隆形成實驗檢測了擴增后的細胞形成克隆形成單位（CFU）的數(shù)量，其代表造血祖細胞的數(shù)量。
　　結(jié)果：我們的結(jié)果顯示臍帶血 CD34+細胞在體外擴增培養(yǎng)過程中 P38 MAPK和mTORC1信號均被活化，LY2228820

6、和Rapamycin可以有效抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號。與單獨使用LY2228820或Rapamycin相比，同時使用LY2228820和 Rapamycin增加了臍帶血 CD34+細胞在體外擴增后 CD34+、CD34+CD38–、CD34+CD45RA–表型造血干/祖細胞在總細胞中的比例。但是，由于Rapamycin的使用導(dǎo)致總細胞擴增倍數(shù)減少，以至于聯(lián)合使用LY2228820和Rapamycin并沒有增加表型造血

7、干/祖細胞的擴增倍數(shù)。另外，克隆形成實驗的結(jié)果顯示，與單獨使用LY2228820或Rapamycin相比，聯(lián)合使用LY2228820和Rapamycin沒有增加CFU-E、CFU-GM、CFU-M、CFU-GEMM和總的CFU數(shù)量，代表其并沒有促進紅細胞祖細胞、粒-巨噬細胞祖細胞、多潛能粒-紅-巨噬-巨核細胞祖細胞以及總的祖細胞擴增或沒有抑制造血祖細胞分化。我們分析 Rapamycin導(dǎo)致總細胞擴增倍數(shù)減少的原因發(fā)現(xiàn)，Rapamycin

8、抑制了細胞增殖，使細胞周期阻滯在G0/G1期，但不影響細胞凋亡。對細胞衰老水平的檢測發(fā)現(xiàn)單獨使用LY2228820或Rapamycin均可以降低細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性，提示其抑制細胞衰老；當同時使用LY2228820和Rapamycin時細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性進一步降低，代表細胞衰老水平進一步降低。
　　結(jié)論：抑制臍帶血CD34+細胞體外擴增過程中活化的P38 MAPK和mTORC1信號通過抑制細胞衰老增加了擴增后表型造血

9、干/祖細胞在總細胞中的比例。
　　第二部分同時抑制細胞衰老和AHR信號促進臍帶血造血干細胞擴增
　　背景：我們前一部分的研究結(jié)果顯示，臍帶血來源的CD34+細胞在體外培養(yǎng)過程中P38 MAPK和mTORC1信號均被活化，共抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號通過降低細胞的衰老水平增加擴增后表型造血干/祖細胞在總細胞中的比例，但并沒有促進表型造血干/祖細胞的擴增，我們分析其可能促進了HSC干性的維持。近年來研究發(fā)現(xiàn)，使

10、用SR1抑制芳香烴受體（AHR）可以抑制HSCs在體外擴增培養(yǎng)過程中細胞的分化，促進HSCs在體外擴增。對敲除AhR基因的小鼠HSCs研究發(fā)現(xiàn)，雖然敲除AhR基因可以增加小鼠骨髓中表型造血干/祖細胞的數(shù)量，但同時也導(dǎo)致HSC喪失了自我更新能力。我們假設(shè)SR1抑制AHR信號促進HSCs擴增的同時也誘發(fā)了細胞衰老，那么在使用SR1抑制細胞分化的基礎(chǔ)上同時抑制細胞衰老可能會進一步增加擴增后細胞的造血重建能力。
　　本研究中我們期望通過調(diào)

11、控細胞衰老和分化進一步促進HSCs擴增，增加擴增后細胞的造血重建能力。因此，我們在前一部分臍帶血CD34+細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入了抑制分化的小分子物質(zhì)SR1，以期通過抑制細胞衰老和分化達到進一步促進HSCs在體外擴增和增加體內(nèi)移植效率的目的。
　　方法：按前一部分擴增臍帶血CD34+細胞的方法擴增細胞，在前期抑制P38 MAPK和mTORC1的基礎(chǔ)上加入SR1抑制AHR信號，同時設(shè)對照組、抑制P38 MAPK和mTORC1組和單獨使用

12、SR1組。擴增后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)p-P38、p-mTOR和CYP1B1分子的表達；檢測擴增后細胞表面CD34、CD38、CD90和CD45RA分子的表達；檢測細胞增殖、凋亡和衰老情況。通過克隆形成實驗檢測擴增后 CFU的形成。選擇重度免疫缺陷 NOD-Prkdcscid Il2rgnull小鼠作為移植受者，未擴增的或擴增后的細胞通過小鼠尾靜脈移植入小鼠體內(nèi)。在移植后第1、4、8周檢測小鼠血液中人源性細胞嵌合率，在移植后第13周

13、檢測小鼠骨髓和脾臟中人源性細胞嵌合率，同時檢測小鼠骨髓中人源性 T、B淋巴細胞、髓細胞、紅細胞、巨核細胞、NK細胞以及造血干/祖細胞占總的人源性細胞的比例。
　　結(jié)果：我們的結(jié)果顯示，使用LY2228820、Rapamycin和SR1可以分別抑制臍帶血CD34+細胞體外培養(yǎng)過程中活化的P38 MAPK、mTORC1和AHR信號。與抑制P38 MAPK和 mTORC1信號或單獨抑制 AHR信號相比，共抑制活化的P38 MAPK、mT

14、ORC1和 AHR信號明顯增加了擴增后 CD34+、CD34+CD38–、CD34+CD90+、CD34+CD45RA–細胞在總細胞中的比例，促進了代表造血干細胞和多潛能造血祖細胞的CD34+CD45RA–細胞擴增?？寺⌒纬蓪嶒灥慕Y(jié)果顯示，相對于抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信號，共抑制活化的P38 MAPK、mTORC1和AHR信號或單獨抑制AHR信號增加了CFU-GM、CFU-GEMM和總CFU的數(shù)量，提示我們共抑制活化的

15、P38 MAPK、mTORC1和AHR信號或單獨抑制AHR信號促進了造血祖細胞擴增或抑制了造血祖細胞的分化。我們對其機制的研究發(fā)現(xiàn)，共抑制活化的P38 MAPK、mTORC1和AHR信號通過降低擴增后細胞的分化和衰老水平從而促進造血干/祖細胞擴增。體內(nèi)實驗的結(jié)果顯示，與未擴增的細胞或?qū)φ战M相比，抑制活化的P38 MAPK和 mTORC1信號或單獨抑制 AHR信號增加擴增后細胞在小鼠血液和骨髓中的植入率；與抑制活化的P38 MAPK和mT