胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外周血造血干細(xì)胞移植對(duì)SCID小鼠造血的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　 外周血造血干細(xì)胞移植(Peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)是目前治療多種實(shí)體瘤和惡性血液病的有效方法。PBSCT的原理主要是用來源于外周血中的造血干/祖細(xì)胞重建患者的免疫和造血功能。PBSCT與傳統(tǒng)的骨髓移植相比較,有如下優(yōu)點(diǎn):移植后患者免疫恢復(fù)早,造血重建快,出血、感染機(jī)會(huì)少,成分輸血和抗生素的應(yīng)用減少,移植后死亡率低;采集PBSC方便,避免

2、穿刺引起的痛苦;多發(fā)性骨髓瘤和侵犯骨髓的患者,腫瘤細(xì)胞浸潤骨髓、骨質(zhì)破壞、骨盆局部放療無法采集骨髓,可采集PBSC代替;和骨髓相比較,外周血中的腫瘤細(xì)胞混入較少,移植后復(fù)發(fā)率相對(duì)較低;PBSCT后的免疫功能重建較早,且回輸了大量的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞,理論上有可能移植物抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)在移植后得到增強(qiáng),能夠清除殘留的病灶,減少其復(fù)發(fā)。近年來,PBSCT逐漸替代了骨髓造血干細(xì)胞的移植。
　　 通常認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenc

3、hymal stem cells,MSCs)是一種多能干細(xì)胞,具有增殖和分化潛能,可以分化為中胚層和外胚層的細(xì)胞,其中包括軟骨細(xì)胞,骨細(xì)胞,肌細(xì)胞,成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,也有可能分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。可以作為造血微環(huán)境的一種主要細(xì)胞成分(骨髓基質(zhì)的前體細(xì)胞),它在造血調(diào)控中起著重要的作用,對(duì)血細(xì)胞的發(fā)育、生成具有非常重要的調(diào)節(jié)和支持作用,能下調(diào)免疫反應(yīng),使移植物抗宿主病(GVHD)很少發(fā)生。其中,骨髓來源的MSC的應(yīng)用更加廣

4、泛。但是MSC在骨髓和外周血等組織中的含量極低,僅僅占到骨髓細(xì)胞的1/104～1/105。并且有研究表明隨著年齡的增長骨髓中的MSC含量會(huì)逐步降低,同時(shí)由于其伴有細(xì)胞增殖分化能力的大大降低,所以其應(yīng)用受到一定的限制。
　　 近些年來,通過研究發(fā)現(xiàn)了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placental mesenchymal stemcells,PMSC)較骨髓具有多個(gè)方面的優(yōu)勢(shì),取材不受限,胎兒只要娩出,胎盤就成為廢物,只要產(chǎn)婦同意,都可以提供

5、胎盤;污染機(jī)會(huì)少,供者無痛苦;不受道德和倫理的約束;所以對(duì)捐獻(xiàn)者沒有任何傷害。人胎盤MSC免疫原性較低,可通過MHC屏障,在免疫調(diào)節(jié)、造血及細(xì)胞歸巢植入等方面起著非常重要的作用。
　　 張毅等通過實(shí)驗(yàn)說明,胎盤MSC對(duì)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增和支持作用比較肯定。HSC移植(HSCT)成功的必需條件是足夠量的HSC/HPC。如果HSC的數(shù)量少,患者的無髓期將變長,使移植失敗幾率增高,危急患者的生命。所以現(xiàn)在越來越重視HSC在體外的擴(kuò)增

6、。
　　 本課題組通過前期研究的結(jié)果顯示:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有體外造血支持作用,其可為造血干細(xì)胞提供造血的微環(huán)境,抑制其分化,促進(jìn)其擴(kuò)增。用作臍血,骨髓,胎盤等來源造血干細(xì)胞在體外擴(kuò)增的滋養(yǎng)層,對(duì)胎盤來源的造血干細(xì)胞的效果最好。
　　 本實(shí)驗(yàn)是在前期研究胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在體外對(duì)不同來源造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增支持作用比較的基礎(chǔ)上探討人胎盤問充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)外周血造血干細(xì)胞在scid小鼠體內(nèi)造血重建的影響。材料:
　　 1.

7、胎盤:正常新鮮健康的胎盤組織來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科。
　　 2.外周血造血干細(xì)胞:外周血造血干細(xì)胞來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院移植科造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者。
　　 3.Scid小鼠:8-10周齡雄性scid小鼠購于北京華阜康生物科技股份公司。
　　 4.主要試劑:胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PBS液均購于美國Hyclone公司,紅細(xì)胞裂解液購于Sigma公司,膠原酶Ⅳ購于Solarbio公司,胰蛋白酶消化液購于北京

8、。
　　 5.細(xì)胞因子和抗體:單克隆抗體抗CD44、CD45、CD105、CD19、CD29、CD34、CD106、HLA-DR、HLA-ABC及UEA-1均購于PharMingen公司。
　　 方法：
　　 1.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定:在無菌條件下取胎盤組織,用Ⅳ型膠原酶消化,用100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾,獲得的細(xì)胞懸液接種含10-20％胎牛血清的培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng),48-72h后換

9、液去除未貼壁細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng),每3天全量換液一次,細(xì)胞按貼壁細(xì)胞的常規(guī)方法傳代。取第3代以后的細(xì)胞,然后分別加入PE或FITC標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。
　　 2.外周血造血干細(xì)胞的分離:通過人類粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員外周血造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者,第5天開始采集。此時(shí)我們通過外周靜脈單采術(shù)而獲得PBSC,所采的干細(xì)胞和粒細(xì)胞通過離心與紅細(xì)胞和血漿等成分分離,將分離的血漿和紅細(xì)胞回輸給供者,完成一次采集

10、的時(shí)間為3～5h。一般通過1～2次采集后,可獲得PBSC數(shù)目為2×106個(gè)細(xì)胞/kg,達(dá)到實(shí)驗(yàn)的需求。
　　 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):移植分為三組:A組為生理鹽水對(duì)照組,B組為外周血造血干細(xì)胞移植組,C組為胎盤問充質(zhì)干細(xì)胞與外周血造血干細(xì)胞聯(lián)合移植組。移植后每天觀察scid小鼠一般狀況,移植后第7、10、14、21、28天細(xì)胞計(jì)數(shù)儀監(jiān)測白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(Plt)水平;移植后28天分別處死實(shí)驗(yàn)小鼠,取其股骨骨髓細(xì)胞

11、,制成細(xì)胞懸液,然后用CD34、CD45單抗標(biāo)記,通過流式分析。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)數(shù)據(jù)資料類型,采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),判斷結(jié)果有無統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了胎盤中存在著間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外周血造血干細(xì)胞移植可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的植入,縮短造血干細(xì)胞移植后造血恢復(fù)時(shí)間,實(shí)驗(yàn)表明單純?cè)煅杉?xì)胞移植組scid小鼠股骨骨髓腔內(nèi)CD45+、CD34+細(xì)

12、胞的百分比分別為5.66±60%、4.23±1.21%;聯(lián)合移植組scid小鼠股骨骨髓腔內(nèi)CD45+、CD34+細(xì)胞的百分比分別為36.54±1.63%、39.06±2.23%。單純?cè)煅杉?xì)胞移植組和聯(lián)合移植組scid小鼠股骨骨髓腔內(nèi)CD45+細(xì)胞相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.458,P＜0.05);單純?cè)煅杉?xì)胞移植組和聯(lián)合移植組scid小鼠股骨骨髓腔內(nèi)CD34+細(xì)胞相比差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=34.150,P＜0.05)。