應(yīng)用RNAi技術(shù)研究LRP1B基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性.pdf

1、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1B(low density lipoprotein receptor-related protein1B，LRP1B)是低密度脂蛋白受體家族的成員。已有研究發(fā)現(xiàn)，LRP1B基因在許多人類腫瘤組織中失活，提示該基因是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LRP1B可調(diào)節(jié)uPA系統(tǒng)相關(guān)分子的代謝，而uPA系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，為闡明LRP1B基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本研究以HEK293細(xì)胞為材

2、料應(yīng)用RNAi技術(shù)特異地封閉LRP1B基因的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)HEK293細(xì)胞生物學(xué)表型的變化來(lái)評(píng)價(jià)LRP1B基因作為候選的腫瘤抑制基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　LRP1B基因是一個(gè)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)達(dá)16.5kb的大轉(zhuǎn)錄本基因。根據(jù)高效siRNA序列特征和靶序列處的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本研究對(duì)LRP1B基因多達(dá)1100個(gè)的siRNA候選靶序列進(jìn)行雙重評(píng)價(jià)，最終在基因轉(zhuǎn)錄本的不同位置選取了6個(gè)siRNA靶位點(diǎn)。針對(duì)這些靶位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了6個(gè)

3、表達(dá)shRNA的pSilencer4.1重組體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并采用半定量RT-PCR檢測(cè)各重組體的沉默效果。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的6個(gè)shRNA重組體中有5個(gè)對(duì)LRP1B基因形成了有效沉默（＞50％），并得到了多個(gè)完全封閉LRP1B基因表達(dá)的HEK293細(xì)胞單克隆。這為后續(xù)的HEK293細(xì)胞的生物表型分析提供了理想的材料。
　　本研究通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)研究了LRP1B基因沉默后HEK293細(xì)胞生

4、長(zhǎng)特性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然封閉LRP1B基因的表達(dá)后HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線并未發(fā)生明顯變化，但在軟瓊脂中形成的集落卻有明顯變大、增多的趨勢(shì)，說(shuō)明LRP1B具有抑制HEK293細(xì)胞非錨定依賴性生長(zhǎng)的功能。本研究又通過(guò)Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞趨化性實(shí)驗(yàn)研究了HEK293細(xì)胞侵襲和趨化性運(yùn)動(dòng)能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，封閉LRP1B基因的表達(dá)增強(qiáng)了HEK293細(xì)胞的侵襲和趨化性運(yùn)動(dòng)能力，并且增強(qiáng)的程度與LRP1B的基因表達(dá)封閉水平