DNA連接酶與DNA聚合酶耦聯(lián)核酸識別體系的建立以及在HIV基因檢測中的應用.pdf

1、目的:建立 DNA連接酶與 DNA聚合酶耦聯(lián)的核酸識別體系以及該體系在HIV基因檢測中的應用初探。
　　方法:選取HIV-1 pol基因保守區(qū)長度為190bp的一段序列作為檢測的靶序列。設計三條長DNA序列A、B、C,A、B、C互為模板進行擴增,從而合成所需 HIV模板。分別設計上下游內(nèi)側(cè)半引物與外側(cè)半引物,運用連接酶與聚合酶耦聯(lián)核酸識別體系檢測有無 HIV模板。本實驗首先進行了半引物長度的探索性研究,然后研究了連接酶緩沖液濃度對

2、DNA聚合酶工作效率的影響,并選取最適濃度,從而優(yōu)化該核酸識別體系。利用連接酶對半引物進行連接反應,然后將連接產(chǎn)物加入到TaqDNA聚合酶介導的PCR體系中,與未加該產(chǎn)物而只加入內(nèi)側(cè)半引物、只加入外側(cè)半引物、以及內(nèi)外側(cè)半引物均加入而不加連接酶的反應體系進行比較,分析連接酶對半引物的連接作用有無,以及連接后是否擴增。比較研究PfuDNA聚合酶介導的PCR體系中,內(nèi)外側(cè)引物的連接缺口處,配對與不配對情況下耦連識別體系的工作效率。本實驗還將正

3、常人基因組DNA加入反應體系中,以檢測引物特異性,以EGFR基因作為陽性對照,觀察該耦聯(lián)體系的檢測作用研究該耦聯(lián)核酸識別體系的工作效率和靈敏度。
　　結(jié)果:用三條人工合成長DNA序列A、B、C互為模板互為引物的方法,在55℃的退火溫度下方便快捷的合成了檢測模板。分別利用三對外側(cè)引物對(HF-1,HR-1;HF-2,HR-2;HF-3,HR-3)以及三對內(nèi)側(cè)引物對(HFP-1,HRP-1;HFP-2,HRP-2;HFP-3,HRP-

4、3)進行擴增反應,較長的HF-1,HR-1;HFP-1,HRP-1;HFP-2,HRP-2均可單獨生成產(chǎn)物,較短的內(nèi)側(cè)半引物對HFP-3,HRP-3與外側(cè)半引物對HF-2,HR-2;HF-3,HR-3不能單獨生成產(chǎn)物。在25μl PCR反應體系中,加入0-1μl的10×連接酶緩沖液,得到DNA連接酶緩沖液與DNA聚合酶緩沖液不同濃度比例的反應體系,實驗結(jié)果表明,未加連接酶緩沖液的體系反應良好,含0.1μl至0.25μl連接酶緩沖液的體系

5、擴增反應依次減弱,當加入0.5μl或更多時,擴增反應被完全抑制,沒有產(chǎn)物。而PfuDNA聚合酶介導引物延伸反應中加入0.1μl的體系反應減弱,當加入0.25μl時反應幾乎完全被抑制,加入0.5μl或更多時,擴增反應被完全抑制,沒有產(chǎn)物。運用上述優(yōu)化的引物HF-3,HR-3;HFP-3,HRP-3以及優(yōu)化的緩沖液比例,在53℃、57℃、61℃、64℃四個溫度梯度下進行反應,結(jié)果在57℃及其更高退火溫度下,只加入內(nèi)側(cè)半引物、只加入外側(cè)半引物

6、、以及內(nèi)外側(cè)半引物均加入的體系中均沒有出現(xiàn)產(chǎn)物,而加入連接反應產(chǎn)物的反應體系均能擴增出目的產(chǎn)物。在PfuDNA聚合酶介導的PCR反應體系中,較高和較低兩種退火溫度下,缺口不配對時均沒有產(chǎn)物,而配對時,均有產(chǎn)物出現(xiàn)。當在反應體系中加入正常人基因組 DNA,并以 EGFR基因作為陽性對照時,加入連接酶的體系中出現(xiàn)目的產(chǎn)物,而未加連接酶的體系中沒有產(chǎn)物。
　　結(jié)論:
　　(1)連接酶反應緩沖液對聚合酶的效率有一定抑制作用。