家蠶核型多角體病毒DNA聚合酶BmNPV-POL的酶學(xué)特性分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)是桿狀病毒的模式病毒之一，由該病毒所引起的家蠶核型多角體病毒病是導(dǎo)致我國夏秋季蠶繭減產(chǎn)的重要原因之一。生命有機體在生長繁殖過程中的一個主要事件就是遺傳信息的傳遞，母代的遺傳信息經(jīng)過DNA的精確復(fù)制得以傳遞給子代，在此過程中DNA聚合酶發(fā)揮著重要作用。由BmNPV ORF53編碼的家蠶核型多角體病毒DNA聚合酶(BmNPV-POL)就扮演著這一重要角色。但是國內(nèi)外對BmNPV-POL的研究較少，無法獲得高純

2、度的活性蛋白可能是其原因之一。
　　本研究首先采用E.coli表達系統(tǒng)來嘗試表達目的蛋白。通過對該基因序列進行密碼子的優(yōu)化以促進蛋白的表達效率，經(jīng)全序列合成之后成功構(gòu)建到pGEX-4T-2載體上，經(jīng)誘導(dǎo)表達后用GST親和層析柱和Mono Q離子交換柱純化出了高純度的融合蛋白GST-BmNPV-POL，經(jīng)Western Blot分析和質(zhì)譜檢測結(jié)果正確，但所純化出的酶活性較低，無法滿足后續(xù)酶學(xué)功能分析的要求。因此，本課題研究又利用桿狀

3、病毒-昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)來制備帶His標(biāo)簽的融合蛋白。首先構(gòu)建帶目的基因的重組病毒并感染Sf-9昆蟲細(xì)胞，利用Ni-NTA親和層析柱從感染后的細(xì)胞粗純化目的蛋白，再利用Mono Q離子交換柱進行進一步純化，獲得的目的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜鑒定結(jié)果正確。
　　Superose6分子篩層析分析結(jié)果表明，真核系統(tǒng)表達的BmNPV-POL是以單聚體的形式在細(xì)胞內(nèi)表達和裝配，分子量約為110 KDa，與理論分子量一致。通過以poly(dA)/oligo(

4、dT)為引物/模板的DNA聚合酶活性分析，獲得了最佳的反應(yīng)條件，在27℃，pH為8.0的條件下，反應(yīng)30min左右，酶活性達最佳，其酶的比活性高達15，126.3 U/mg。研究發(fā)現(xiàn)KCl對BmNPV-POL的DNA聚合酶活性有一定的抑制作用，在0-50 mM濃度范圍內(nèi)酶活性幾乎不受影響，但鹽濃度超過50mM后，隨著KCl濃度的升高，酶活性迅速降低。DMSO也會抑制酶的活性，隨著DMSO濃度的升高，酶活性逐漸減低，在20％的DMSO存在

5、的條件下，酶活性降至原來的三分之一。此外，該酶對Aphidicolin比較敏感，0.125μg/mL濃度的Aphidicolin就能使得酶活性急速下降。在以單鏈環(huán)狀M13為模板的“M13”DNA活性分析時發(fā)現(xiàn)，BmNPV-POL在DNA復(fù)制過程中不依賴PCNA和RFC，但SSB可以促進病毒DNA的復(fù)制進程。
　　本論文研究結(jié)果為家蠶桿狀病毒DNA復(fù)制機制的研究打下理論基礎(chǔ)，也為由于BmNPV引起的家蠶膿病的生物防治以及利用家蠶作為