Taq DNA聚合酶的改造及應用.pdf

1、本論文對Taq DNA聚合酶展開了研究，從Taq DNA聚合酶表達載體出發(fā)，對其進行定向改造，分別用于探針檢測PCR體系和焦磷酸水解激活的聚合酶反應(PAP)技術，最后制備其抗體達到熱啟動PCR的目的。 第一章，概述了Taq DNA聚合酶在PCR中的應用，普通Taq DNA聚合酶雖然得到廣泛使用，但是仍然存在不足。各個實驗室針對Taq DNA聚合酶的不足進行了不同形式的改造，以降低或消除酶的5'→3'核酸外切酶活性，提高酶的續(xù)

2、進性、忠實性、特異性和耐熱性等。 第二章，我們也通過定點突變和缺失突變的方法在基因水平對Taq DNA聚合酶進行改造，以消除酶的5'→3'核酸外切酶活性和降低Taq DNA聚合酶對ddNTP的抵抗，并對改造后的酶蛋白進行表達純化。 第三章，將改造的酶進行了各方面的應用。第一，應用于探針檢測實時PCR體系。在各種基于探針檢測的實時PCR體系中，使用普通的Taq DNA聚合酶，有時看不到S型信號升起，在PCR循環(huán)的開始，

3、探針的熒光信號本底就很高。我們將改造后的酶應用于探針檢測，發(fā)現(xiàn)可以很好地解決這一問題，同時也進一步驗證了初始熒光信號本底高是由于探針的熒光基團被具有5'→3'核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶酶切造成。第二，應用于PAP技術。PAP技術即焦磷酸水解激活的聚合酶反應技術。在PAP反應體系中，應用普通的Taq DNA聚合酶無法進行突變的檢測，我們改造后的Taq-FS DNA聚合酶，可以成功地解決這一問題，進行稀有突變的檢測，可以區(qū)分單堿基