miR-494對脂多糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　觀察 miR-494在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）中的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討miR-494對HK-2細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)HK-2，給予1 ug/ml LPS分別干預(yù)0 h、1 h、3 h、6 h、12 h。采用Real-time PCR檢測miR-494的表達(dá)變化。
　　2、構(gòu)建miR-494慢病毒過表達(dá)及陰性對照載體，轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，熒光顯

2、微鏡下估算轉(zhuǎn)染效率。
　　3、將HK-2分為四組：control組、LPS刺激組、miR-494過表達(dá)+LPS組、miR-494陰性轉(zhuǎn)染+LPS組，除control組外，各組細(xì)胞予以相應(yīng)處理后再均以1 ug/ml LPS干預(yù)6 h。用Real-time PCR檢測各組miR-494、ATF3的表達(dá)水平。Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞法分別檢測各組細(xì)胞的凋亡率。采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α的濃

3、度。
　　結(jié)果：
　　1、LPS刺激1 h后，HK-2細(xì)胞中miR-494的表達(dá)水平即達(dá)到頂峰，為0 h組的3.19±0.21倍（P＜0.05），3 h、6 h和12 h的表達(dá)量逐漸下降，與0 h組的miR-494表達(dá)量均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、LV-miR-494慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察ZsGreen綠色熒光，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80％以上，qPCR檢測LV-miR-494+LPS組細(xì)胞miR-494

4、較control組的表達(dá)水平為8.57±0.50倍（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示轉(zhuǎn)染成功。
　　3、與control相比，LV-miR-494+LPS組、LV+LPS組及LPS組的miR-494表達(dá)水平分別為（8.57±0.50 vs2.47±0.04 vs2.34±0.02）；ATF3 mRNA表達(dá)水平為（2.12±0.37 vs5.84±0.42 vs5.45±0.53），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）
　

5、　4、流式細(xì)胞檢測各組 HK-2細(xì)胞凋亡水平：與 control組比較，LPS組、LV-miR-494+LPS組及LV+LPS組的細(xì)胞凋亡率明顯高于control組（P＜0.05），LV+LPS組與LPS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5、ELISA法檢測各組細(xì)胞 IL-6、TNF-α的濃度：在LPS刺激下 LV-miR-494+LPS組、LV+LPS組、LPS組IL-6、TNF-α蛋白水平較control組均顯著

6、提高，且LV-miR-494+LPS組與其它兩組相比，IL-6、TNF-α蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明miR-494的過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α有促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　1、LPS可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡。
　　2、重組慢病毒轉(zhuǎn)染HK-2后，miR-494表達(dá)明顯上調(diào)，其靶基因ATF3表達(dá)下調(diào)。
　　3、過表達(dá)miR-494可顯著促進(jìn)炎性因子的釋放，增強(qiáng)L