黃芩苷對高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:本研究從細胞增殖、細胞凋亡以及細胞凋亡因子方面研究觀察在高糖環(huán)境下不同濃度的黃芩苷對人腎小管上皮細胞(HK-2)細胞凋亡的影響，為糖尿病腎病的中醫(yī)藥防治提供實驗依據。
　　方法:
　　1.篩選HK-2細胞的生長曲線和合適藥物濃度:培養(yǎng)細胞，通過MTT法分別在24h、48h、72h、96h、120h分別檢測1000個/孔、2000個/孔、4000個/孔以及8000個/孔細胞密度的HK-2細胞生長情況，擬合生長趨勢曲線篩選

2、細胞密度;在4000個/孔的細胞密度下，分別在24h、48h、72h檢測羅格列酮（陽性對照藥）與黃芩苷（試驗藥）藥物干預下HK-2細胞增殖情況，通過計算抑制率篩選藥物濃度。
　　2.細胞增殖檢測:培養(yǎng)細胞，通過MTT法分別在24h、48h、72h檢測在高糖作用下不同濃度的陽性對照藥(5μ mol/L、10μ mol/L)、試驗藥(50μ mol/L、100μ mol/L、200μ mol/L)干預下HK-2細胞增殖情況。
　

3、　3.細胞凋亡檢測:通過hoechest33342染色檢測細胞凋亡的形態(tài)學表現;通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法定量檢測細胞凋亡。
　　4.細胞凋亡因子檢測:通過免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、PKC、TGF-β表達對HK-2細胞凋亡的影響。
　　結果:
　　1.檢測HK-2細胞的生長曲線和篩選合適藥物濃度
　　(1)檢測HK-2細胞的生長曲線:通過檢測HK-2的生長曲線，發(fā)現4000/孔的細胞密度隨

4、著培養(yǎng)時間的延長，細胞呈指數生長趨勢，符合細胞正常生長周期，選取4000/孔的細胞密度進行后續(xù)實驗，根據細胞指數增生期情況，選取處于在指數增生期的1/3至1/2處的24h、48h、72h作為觀察時間點。
　　(2)篩選陽性對照藥（羅格列酮）的合適藥物濃度:通過對2.5μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L、20μ mol/L的羅格列酮藥物濃度篩選實驗可知，低糖組、高糖組、羅格列酮組（4個組別）的OD值，分別從24h的

5、0.399±0.061到72h的0.874±0.073、24h的0.301±0.026到72h的0.561±0.024、24h的0.368±0.043到72h的0.743±0.021、24h的0.395±0.013到72h的0.707±0.048、24h的0.366±0.018到72h的0.686±0.011、24h的0.329±0.039到72h的0.392±0.020變化。當羅格列酮藥物濃度為20μmol/L對HK-2細胞的毒性較大

6、，故本實驗選取5μ mol/L、10μ mol/L作為陽性對照藥物濃度。
　　(3)篩選試驗藥（黃芩苷）的合適藥物濃度:通過對50μ mol/L、100μ mol/L、200μ mol/L、400μ mol/L、800μ mol/L的黃芩苷藥物濃度篩選實驗可知，低糖組、高糖組、黃芩苷（5個組別）的OD值，分別從24h的0.441±0.014到72h的0.788±0.028、24h的0.494±0.021到72h的0.618±0.0

7、24、24h的0.462±0.014到72h的0.575±0.021、24h的0.517±0.029到72h的0.544±0.040、24h的0.506±0.007到72h的0.608±0.038、24h的0.592±0.059到72h的0.561±0.027、24h的0.343±0.038到72h的0.221±0.025變化。當黃芩苷藥物濃度超過200μ mol/L時，對細胞的毒性開始隨著藥物濃度的升高而毒性增大（抑制率顯著上升）并伴

8、有細胞形態(tài)的改變，故選取50μ mol/L、100μ mol/L、200μ mol/L的藥物濃度進行接下來的實驗。
　　2.細胞增殖檢測:通過MTT法分別在24h、48h、72h檢測低糖組、高糖組、羅格列酮（2個組別）以及黃芩苷（3個組別）的OD值，各組OD值分別從24h的0.331±0.017到72h的0.993±0.071、24h的0.384±0.014到72h的0.742±0.031、24h的0.419±0.024到72h的

9、0.734±0.079、24h的0.382±0.035到72h的0.646±0.039、24h的0.512±0.019到72h的0.857±0.046、24h的0.535±0.011到72h的0.789±0.042、24h的0.492±0.041到72h的0.562±0.101。結果發(fā)現，黃芩苷對于高糖刺激下的HK-2細胞以促進增殖為主。
　　3.細胞凋亡檢測:通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測凋亡率，低糖組、羅格列酮

10、組（2個組別）的凋亡率隨時間的延長而有輕微上升趨勢，分別從24h的2.97±0.91％到72h的3.73±2.19％、24h的6.73±3.25％到72h的7.03±2.57％、24h的5.20±0.20％到72h的6.27±2.83％;高糖組、黃芩苷組（3個組別）的凋亡率隨時間的延長呈下降趨勢分別從24h的7.70±4.76％的到72h的7.27±3.15％，從24h的7.57±3.07％的到72h的3.60±1.40％，從24h的6

11、.33±1.82％的到72h的5.53±2.45％，從24h的7.83±4.57％的到72h的4.93±3.11％。結果顯示，黃芩苷可明顯抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，其凋亡率呈藥物濃度依賴性。
　　4.細胞凋亡因子檢測:通過免疫組化檢測，HK-2細胞經不同濃度羅格列酮和黃芩苷處理24小時后，觀察到各組別的Bax、Bcl-2、TGF-β、PKC的表達在低糖組呈陰性或弱陽性。
　　結論:黃芩苷在高糖作用下對HK-2細胞呈現