自噬對組蛋白介導的人腎小管上皮細胞凋亡的影響.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是ICU常見病之一，發(fā)病率正逐年增高。研究顯示腎小管細胞凋亡為其重要發(fā)病機理之一。組蛋白是真核生物染色質的主要結構蛋白，然而，有研究提出細胞外組蛋白也是一種內(nèi)源性損傷相關模式分子(damage associated molecular patterns，DAMPs)，其在AKI發(fā)病機理中有著重要作用。研究顯示，通過小鼠腎動脈注射組蛋白，可以引起中性粒細胞浸潤、微血管滲漏、腎臟炎

2、癥反應以及AKI病理改變。體內(nèi)外實驗證實細胞外組蛋白可導致腎小管上皮細胞凋亡。
　　自噬是指膜包裹胞質蛋白或細胞器等進行降解的一種動態(tài)過程，起維持細胞穩(wěn)態(tài)及更新細胞器的作用。同時，自噬也是一種應激調控機制，許多AKI模型中已證實自噬是上調的。有大量研究提出自噬可以抑制凋亡，比如在饑餓或生長因子缺乏時，自噬可以抑制凋亡保證細胞存活。研究報道，在缺血/再灌注腎損傷小鼠模型，自噬水平提高，而用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyla

3、denine，3-MA)或者氯喹預處理，腎細胞凋亡增加。目前已經(jīng)明確應激情況下產(chǎn)生的過多反應活性氧類(Reactive oxygen species，ROS)可以導致細胞凋亡。自噬是否通過減少ROS的產(chǎn)生從而抑制組蛋白誘導的人腎小管上皮細胞(HK-2)凋亡尚未清楚，本實驗將針對此方面進行觀測與探討。
　　研究目的：
　　1.明確組蛋白是否可以誘導HK-2凋亡及自噬;
　　2.探討自噬是否通過減少ROS產(chǎn)生來抑制組蛋白介

4、導的HK-2凋亡。
　　研究方法：
　　1.以不同濃度組蛋白刺激HK-2，分別應用流式細胞術和免疫印跡法檢測HK-2凋亡情況和自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達的情況，初步了解組蛋白對HK-2凋亡和自噬的影響。
　　2.以自噬抑制劑3-MA預處理后，分別應用流式細胞術和免疫印跡法檢測組蛋白誘導的HK-2凋亡情況和caspase3活化情況，明確自噬對凋亡的作用。
　　3.以自噬抑制劑3-MA預處理后，應用流式

5、細胞術檢測組蛋白誘導的HK-2的ROS生成量，進而明確自噬是否通過減少ROS產(chǎn)生從而抑制組蛋白介導的HK-2凋亡。
　　統(tǒng)計學處理
　　使用IBM SPSS21統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以(X)±S表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，進一步組間均值兩兩比較采用LSD法或Dunnett's T3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：
　　1.不同濃度組蛋白對HK-2凋亡的影響
　　流式結果

6、顯示，不同濃度組蛋白對HK-2凋亡的影響有統(tǒng)計學差異(F=57.497，P＜0.01)。組間兩兩比較顯示：與對照組(7.94±1.78％)比較，組蛋白25、50、100ug/ml組（17.31±4.41％，27.98±2.45％，53.15±7.12％）隨著濃度升高而出現(xiàn)早期和晚期凋亡所占的比例依次升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　2.不同濃度組蛋白對HK-2Beclin1和LC3Ⅱ表達的影響
　　灰度

7、分析提示不同濃度組蛋白對HK-2Beclin1和LC3Ⅱ表達差異有統(tǒng)計學意義(F=4.279、4.815，P＜0.05)。與對照組比較，各濃度組蛋白組LC3Ⅱ、Beclin1表達水平均升高(P＜0.05)。
　　3.3-MA對組蛋白誘導的HK-2凋亡的影響
　　流式及Western blotting結果分別顯示，單純3-MA處理對HK-2凋亡率及caspase3活化水平無影響(P＞0.05)，但顯著提高了組蛋白誘導的HK-2