耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分子特征及替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮-舒巴坦對其抗菌作用的研究.pdf

1、目的:分析耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（CRAB）的分子特征并評價(jià)替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦對CRAB的體外、體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)活性。
　　方法:
　　(1)應(yīng)用RT-PCR檢測該院臨床分離的非重復(fù)87株CRAB攜帶blaTEM，blaGES,blaSHV,blaKPC,blaCTX-M-1,blaVIM-1,blaVIM-2,blaIMP-1,blaIMP-2,blaSIM-1,blaNDM-1, blaOXA-23-like，b

2、laOXA-24-like，blaOX-51-like，blaOXA-58-like等15個(gè)碳青霉烯酶耐藥基因情況并測序。
　　(2)應(yīng)用微量肉湯稀釋法測定聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)，應(yīng)用時(shí)間—?dú)⒕€評價(jià)替加環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦及聯(lián)合用藥的體外效果。
　　(3)C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射最低致死劑量的CRAB建立腹膜炎/膿毒癥小鼠模型，分析給藥4h和18h小鼠血、肺、肝、脾、腎各臟器菌落數(shù)并觀察病理。
　　(4)建

3、立細(xì)胞內(nèi)感染鮑曼不動桿菌模型:小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7與CRAB孵育4h，慶大霉素清除細(xì)胞外細(xì)菌，細(xì)胞培養(yǎng)24h。電鏡觀察細(xì)胞吞噬細(xì)菌及細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的狀態(tài)。評價(jià)各抗菌藥物的細(xì)胞內(nèi)外抑菌濃度(Cs)和最大相對效應(yīng)(Emax)，并繪制量效曲線和時(shí)間—?dú)⒕€。
　　結(jié)果:
　　(1)87株CRAB共攜帶4種碳青霉烯酶基因:blaOXA-51-like(97.7％)，blaOXA-23-like(95.4％)，blaTEM(

4、85.1％)和blaOXA-58-like(2.3％)。耐藥模式最多為:blaTEM+blaOXA-23+blaOXA-51-like(83.9％)。
　　(2)單藥時(shí):替加環(huán)素MIC＜Cmax的CRAB比例為57.5％，頭孢哌酮/舒巴坦敏感率為12.6％。兩藥聯(lián)合時(shí)，替加環(huán)素MIC＜Cmax的比例為96.6％，頭孢哌酮/舒巴坦的敏感率為44.8％。聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)≤0.5的比例為25.3％。時(shí)間—?dú)⒕€:1/2×MIC

5、和1×MIC的聯(lián)合用藥在AB-8、AB-14、AB-44菌株呈協(xié)同作用，并能清除肉湯中的細(xì)菌，但替加環(huán)素聯(lián)合等劑量的舒巴坦卻在24 h后出現(xiàn)了細(xì)菌的再生長。
　　(3)腹膜炎/膿毒癥小鼠死亡率:替加環(huán)素單藥和聯(lián)合用藥較模型組(0％ VS100％，P＜0.05)和頭孢哌酮/舒巴坦單藥組(0％ VS50％，P＜0.05)明顯下降。肺、肝、脾、腎等組織病理炎癥明顯減輕。給藥4h:替加環(huán)素與聯(lián)合用藥組各臟器的菌落數(shù)均較模型組及頭孢哌酮/舒

6、巴坦組減少（替加環(huán)素:血5.64±0.16log10 CFU/mL，肺5.73±0.09log10CFU/g，肝6.34±0.17log10 CFU/g，脾7.11±0.17log10 CFU/g，腎5.98±0.13log10 CFU/g;聯(lián)合用藥組:血5.13±0.20log10 CFU/mL，肺5.09±0.06log10 CFU/g，肝5.81±0.16log10CFU/g，脾7.17±0.09log10 CFU/g，腎5.71

7、±0.18log10 CFU/g;模型組:血7.18±0.27log10 CFU/mL，肺7.19±0.31log10 CFU/g，肝8.11±0.21 log10 CFU/g，脾8.16±0.26 log10CFU/g，腎7.67±0.31 log10 CFU/g;頭孢哌酮/舒巴坦組:血6.27±0.26log10 CFU/mL，肺6.21±0.37log10 CFU/g，肝7.01±0.17log10 CFU/g，脾7.92±0.1

8、5log10 CFU/g，腎6.87±0.31 log10 CFU/g);聯(lián)合用藥與替加環(huán)素單藥相比，肺、肝菌落數(shù)明顯下降(-0.63±0.11log10 CFU/g、-0.53±0.23log10 CFU/g)。替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦與替加環(huán)素聯(lián)合等劑量的舒巴坦比較，作用4h各臟器的菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但作用18h前者肝臟的菌落數(shù)明顯下降（4.40±0.17log10CFU/g VS4.86±0.12log10 CFU/g，

9、P＜0.05）。
　　(4)透射電鏡觀察到細(xì)菌在RAW264.7細(xì)胞液泡中復(fù)制。頭孢哌酮/舒巴坦作用6h時(shí)并不能抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長，但是延長至24 h，可抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌生長;而替加環(huán)素作用6h即能抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌生長;聯(lián)合用藥細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間—?dú)⒕€與替加環(huán)素單藥基本重合。頭孢哌酮/舒巴坦的抑菌濃度(Cs)在細(xì)胞內(nèi)外基本都在MIC值附近，而替加環(huán)素細(xì)胞內(nèi)Cs僅為細(xì)胞外的1/10×MIC。替加環(huán)素細(xì)胞內(nèi)最大相對效應(yīng)(Emax)為-2.

10、37log10CFU/mg prot;頭孢哌酮/舒巴坦細(xì)胞內(nèi)Emax為-1.53 log10CFU/mg prot。
　　結(jié)論:
　　(1)本實(shí)驗(yàn)分離的CRAB主要攜帶blaOXA-51-like，blaOXA-23-like，blaTEM和blaOXA-58-like四種基因。
　　(2)替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦較單藥或替加環(huán)素聯(lián)合等劑量舒巴坦對體外、體內(nèi)的CRAB有更好的抗菌活性。
　　(3)替加環(huán)素對細(xì)