L-精氨酸產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、本論文應(yīng)用代謝控制發(fā)酵原理，以本實(shí)驗(yàn)室保藏的谷氨酸棒桿菌UNC90分純得到的菌株ZH-84為出發(fā)菌株，進(jìn)行L-精氨酸產(chǎn)生菌的選育，繼而對(duì)其搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并分析了ZH-84及其突變株在L-精氨酸形成階段的代謝流量分布情況。主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.以谷氨酸棒桿菌ZH-84為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)、紫外線(UV)、亞硝基胍(NTG)等逐級(jí)誘變處理，依次賦予磺胺胍抗性(SGR)、精氨酸甲基酯抗性(AER)、D-精氨酸

2、抗性(D-ArgR)、半胱氨酸抗性(CysR)及琥珀酸為唯一碳源(Sucg)平板定向篩選，得到一株L-精氨酸產(chǎn)生菌ZH5-82，在未經(jīng)優(yōu)化的條件下可積累L-精氨酸16g/L，比出發(fā)菌株提高了近2倍。 2.通過對(duì)種子培養(yǎng)基正交分析，優(yōu)化確定了菌株ZH5-82合成L-精氨酸的最佳種子培養(yǎng)基組成及配比(g/L)：葡萄糖30，(NH4)2SO420，玉米漿20，豆餅水解液10，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O0.5，CaCO31

3、0，pH7.0，同時(shí)確定最佳接種量為6％。 3.發(fā)酵培養(yǎng)基采用二水平正交試驗(yàn)，從六種主要成份中篩選出三種影響最顯著的因素：葡萄糖、(NH4)2SO4和玉米漿，并用響應(yīng)面分析對(duì)這三種因素水平進(jìn)行了優(yōu)化，從而確定了發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方(g/L)：葡萄糖90，(NH4)2SO430，玉米漿25，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O0.5，生物素80μg/L，CaCO330。在此培養(yǎng)條件下，采用250mL三角瓶裝液15mL，往復(fù)式搖床

4、30+1℃，轉(zhuǎn)速為100次/min，發(fā)酵96h，產(chǎn)酸水平可穩(wěn)定在18.3g/L，比未經(jīng)優(yōu)化時(shí)提高了約13％。 4.考察了發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氨基酸、有機(jī)酸、維生素、醇類、表面活性劑、氯霉素以及其它營(yíng)養(yǎng)源對(duì)產(chǎn)酸的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加低濃度的谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和甘氨酸對(duì)菌體產(chǎn)酸促進(jìn)作用較大；有機(jī)酸中添加琥珀酸效果較好；維生素中煙酸、葉酸、VB6和低濃度的硫胺素可促進(jìn)產(chǎn)酸；醇類添加效果不佳；表面活性劑除低濃度的SDS

5、外基本抑制產(chǎn)酸；添加牛肉膏等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可提高產(chǎn)酸，但提高幅度不大。 5.對(duì)搖瓶中流加補(bǔ)料進(jìn)行了初步研究。研究發(fā)現(xiàn)，流加糖、氨水效果較好，產(chǎn)酸可提高15％左右；流加尿素影響不大；發(fā)酵中后期流加前體谷氨酸可稍微提高產(chǎn)酸。 6.運(yùn)用代謝流量分析理論和L-精氨酸生物合成的代謝機(jī)制為基礎(chǔ)，構(gòu)建了L-精氨酸生物合成的網(wǎng)絡(luò)模型，計(jì)算得到L-精氨酸合成的最大理論摩爾轉(zhuǎn)化率為1mol/mol，考慮輔因子限制后的最大化學(xué)計(jì)量摩爾轉(zhuǎn)化率為0.8