基于GS篩選系統(tǒng)的動物細胞高效表達載體的構(gòu)建及應用.pdf

1、近年來，隨著臨床治療應用的單克隆抗體(mAb)的數(shù)量顯著增加，其中特別是治療癌癥，自身免疫性疾病，過敏性疾病，移植和抗獨特型疫苗等單克隆抗體。伴隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的進步，特別是哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，提高了單克隆抗體和其他重組蛋白的表達量。在哺乳動物細胞中生產(chǎn)的單克隆抗體包括一個漫長的過程，涉及到目的基因轉(zhuǎn)染細胞的克隆選擇，培養(yǎng)條件不斷優(yōu)化，小型生物反應器中培養(yǎng)以及規(guī)?；I(yè)水平。事實上，由于單克隆抗體的高需求，需要建立大規(guī)模的生產(chǎn)過

2、程，以滿足市場的需求。
　　單克隆抗體的生產(chǎn)的優(yōu)化不僅在生物反應器中，而且在生產(chǎn)的早期階段，其中有幾個因素發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響單抗或重組蛋白生產(chǎn)的最終結(jié)果。事實上，它們是已知的幾個參數(shù)，如細胞類型，轉(zhuǎn)染載體，載體的啟動子，轉(zhuǎn)染和克隆選擇的方法，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和生長介質(zhì)等，對最終的表達水平有很大的影響。因此，優(yōu)化單克隆抗體或重組蛋白表達法不僅在生物反應器培養(yǎng)過程中，而且應該在開始的幾個階段。
　　本課題研究類抗體化重組蛋白表達的優(yōu)化

3、過程，在載體篩選系統(tǒng)、啟動子元件、懸浮適應期篩選、無血清培養(yǎng)基優(yōu)化和流加培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面進行研究。
　　在研究中我們得出如下結(jié)論:
　　將pIRES2-EGFP-B載體加上GS篩選標記和hCMV啟動子，成功構(gòu)建了pHGS1.0載體。通過插入目的基因，轉(zhuǎn)染細胞，進行WB實驗證實成功表達目標蛋白，大約90kD。G418和MSX篩選，轉(zhuǎn)染細胞在進行G418和MSX聯(lián)合篩選表達量最高，細胞熒光強度也最強。篩選單克隆，挑選了20株單

4、克隆，進行OD450和IgG2定量試劑盒檢測蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)篩選的20個單克隆中，2、6、8、9、10、12和13株成陰性，其他都呈現(xiàn)陽性。進行定量分析，15株細胞系蛋白表達量最高，接近4μg/mL。
　　在有血清培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)細胞生長代謝，細胞最大細胞密度4×106cell/mL，重組蛋白表達量達到3μg/mL，細胞最大比生長速率μ為0.35d-1，最高表達率q為3.5μg/mL/cell/d。葡萄糖比消耗率隨著細胞密度升高逐

5、漸降低后又升高，乳酸比產(chǎn)率先下降后上升又下降。
　　在懸浮適應階段前期培養(yǎng)細胞生長代謝，通過添加F-68調(diào)節(jié)，細胞在適應階段最大細胞密度為2.5×106cell/mL，重組蛋白表達量達到3.8μg/mL。硫酸葡聚糖濃度在25μg/mL時，細胞生長狀態(tài)最好，蛋白表達量可以達到3.6μg/mL。
　　在懸浮適應階段后期培養(yǎng)細胞生長代謝，細胞比生長率提高到0.34d-1，重組蛋白表達量提高到6μg/mL。其中葡萄糖比消耗率和乳酸比

6、產(chǎn)率基本維持不變。
　　無血清培養(yǎng)基優(yōu)化，Plackett-Burman篩選方法通過對培養(yǎng)基中19種成分進行篩選，其中胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和腐胺三個因素起到關(guān)鍵作用。響應面實驗分析結(jié)果顯示，當胰島素濃度為2.78mg/L，腐胺濃度0.78mg/L，轉(zhuǎn)特蛋白濃度為8.6mg/L，最高細胞密度達到4.2×106cell/mL。細胞在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重組蛋白表達量最大可以達到5μg/L。
　　利用MATLAB軟件建立對數(shù)生長期細胞在

7、無血清批次培養(yǎng)條件下和有血清貼壁培養(yǎng)條件下生長代謝、乳酸生成和葡萄糖消耗動力學模型，為后期大規(guī)模培養(yǎng)奠定了一個良好理論基礎(chǔ)。
　　在有血清貼壁培養(yǎng)和無血清批次培養(yǎng)條件下細胞穩(wěn)定性比較，細胞系連續(xù)進行傳代16次，無血清批次培養(yǎng)比有血清細胞穩(wěn)定性要好，細胞在傳代后期基本還是維持一個很高細胞密度，而有血清培養(yǎng)細胞在密度和細胞活率后出現(xiàn)明顯波動。
　　流加培養(yǎng)條件優(yōu)化，起始接種密度對細胞最大生長密度和蛋白表達量影響不是很明顯，細胞最

8、高生長密度都能達到6-7×106cell/mL，蛋白表達量都在4.5μg/mL左右。培養(yǎng)溫度低有利于蛋白表達積累，細胞最大生長密度基本無影響，33℃培養(yǎng)細胞蛋白表達量達到9μg/mL水平，比其他兩個培養(yǎng)溫度下蛋白表達水平提高接近2倍。
　　pH對細胞生長密度及代謝影響，pH維持在5.5左右時，培養(yǎng)后期活細胞密度維持在6×106cell/mL左右，蛋白表達量也是最高的。調(diào)節(jié)pH值時間發(fā)現(xiàn)，在24h后調(diào)節(jié)pH值，更能夠提高細胞表達量和