哺乳動物細胞展示型人源ScFv抗體庫構(gòu)建及靶向ErbB3 ScFv篩選.pdf

1、抗體藥物是目前研究和應用最為廣泛的一類生物技術(shù)藥物,是腫瘤、感染、炎癥等疾病的重要治療手段。全人源抗體藥物因其免疫原性低,在迄今美國食品藥品監(jiān)督管理局(American Food and Drug Administration,FDA)批準上市的抗體類藥物中(僅指含抗體可變區(qū)的抗體藥物)占有很大的比重,已成為未來臨床應用抗體發(fā)展的趨勢。目前,全人源抗體候選序列主要通過噬菌體展示文庫篩選獲得,再改構(gòu)到哺乳動物細胞中進行大量生產(chǎn)表達,這使“

2、萬里挑一”獲得的抗體在從原核到真核的過程中面臨很大的親和力改變等風險。相比之下,基于哺乳動物細胞抗體庫篩選出的候選抗體將原核表達系統(tǒng)篩選抗體具備的風險和弊端大大降低。目前,哺乳動物細胞抗體庫技術(shù)報道有限,在國內(nèi)外仍處于起步階段,具有很大的學術(shù)意義和應用價值。本研究擬構(gòu)建真核哺乳動物細胞展示型單鏈抗體(single—chain antibody fragment,ScFv)庫,并選取表皮生長因子受體-3(v-erb-b2 avian er

3、ythroblastic leukemia viral oncogene homolog3,ErbB3)為靶點進行ScFv抗體篩選以驗證本抗體庫的有效性。
　　第一部分構(gòu)建真核哺乳動物細胞展示型ScFv抗體庫。
　　本研究首先收集包括多種病種及健康志愿者在內(nèi)共120例志愿者外周血淋巴細胞,通過提取總核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)并反轉(zhuǎn)錄獲得互補脫氧核糖核苷酸(complementary Deoxyrib

4、onucleic acid,cDNA),作為擴增人抗體庫可變區(qū)基因的模板。參照文獻設計28對簡并引物擴增重鏈可變區(qū),設計16對簡并引物擴增輕鏈可變區(qū)。利用上述引物通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增、膠回收分別獲得重鏈抗體可變區(qū)(Heavy-chain variable region,VH)和輕鏈抗體可變區(qū)(Light-chain variable region,VL)庫。通過重疊PCR,

5、以(G4S)3的linker將VH及VL連接成單鏈抗體ScFv。通過Sfi I及Sal I雙酶切位點將ScFv連接至載體 pDisplay,構(gòu)建重組質(zhì)粒庫 pDisplay-ScFv。隨機挑選質(zhì)粒庫pDisplay-ScFv單克隆并進行測序,并將VH及VL基因在IgBlast-IMGT數(shù)據(jù)庫中進行比對,結(jié)果顯示其均為有活性的人免疫球蛋白可變區(qū)基因,從而驗證抗體庫的有效性、多樣性、庫容量(pDisplay-ScFv質(zhì)粒庫的庫容量約為107

6、)。將質(zhì)粒庫瞬時轉(zhuǎn)染到293T細胞中,培養(yǎng)60 h后收細胞,利用ScFv蛋白C端帶有的myc標簽,用FITC標記的抗myc抗體對其進行流式分析實驗,以確定該質(zhì)粒庫能夠得到有效表達于細胞表面(結(jié)合轉(zhuǎn)染效率,表達效率約為20％)。另外,還收集轉(zhuǎn)染后24 h的細胞,同樣利用myc標簽對其進行Western Blot實驗,驗證其抗體庫表達蛋白大小的正確性(約為26 kDa)。因此,我們成功構(gòu)建了一個具有一定多樣性、有效性,并將ScFv抗體表達于

7、哺乳動物細胞表面的展示型人源ScFv抗體庫。
　　第二部分哺乳動物細胞展示型ScFv抗體庫的驗證
　　近期研究證明,酪氨酸激酶表皮生長因子受體家族成員之一的ErbB3,是表皮生長因子受體-1(epidermal growth factor receptor,EGFR/ErbB1)、表皮生長因子受體-2(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2

8、,ErbB2)抗體藥物臨床應用產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素,此外還直接參與介導多種ErbB3過表達腫瘤,如人骨肉瘤、黑色素瘤等的發(fā)生、惡化。以 ErbB3為靶點的藥物研發(fā)是近年的熱點。在該部分研究中,我們擬基于前期構(gòu)建的哺乳動物細胞表面的展示型人源ScFv抗體庫,篩選ErbB3 ScFv抗體以驗證該抗體庫的有效性和實用性。
　　首先構(gòu)建ErbB3的胞外區(qū)(extracellular domain,ECD)蛋白及胞外配體結(jié)合區(qū)(recept

9、or ligand-binding domain,RLD)蛋白用于篩選ScFv抗體。利用原核表達系統(tǒng),將 ErbB3的胞外區(qū) ECD基因和胞外配體結(jié)合區(qū) RLD基因分別構(gòu)建至pET-28a(+)和pGEX-KG原核表達載體。通過菌液PCR、測序篩選陽性單克隆。將陽性單克隆轉(zhuǎn)化到原核表達菌BL(DE3)中進行表達并純化。將純化后的ECD蛋白和RLD蛋白標記熒光素異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC

10、);通過FITC標記的抗原蛋白利用流式細胞分選技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)從文庫中篩選靶向ErbB3的特異性抗體,并對其親和力進行初步檢測。
　　為驗證實驗設計的可行性,我們選取PubMed公布的ErbB3 ECD ScFv(噬菌體抗體庫中篩選獲得)序列,并將其構(gòu)建到 pDisplay載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pDisplay-ErbB3 ScFv并混入到質(zhì)粒庫中作為陽性對照。我

11、們分別用10 nM、2 nM、0.8 nM標記后蛋白進行三輪流式分選,每輪篩選30 ml細胞,細胞密度為1×106/ml。第三輪篩選結(jié)束隨機挑選單克隆測序,在測序得到的35個單克隆序列中,候選序列22號出現(xiàn)9次,候選序列31號出現(xiàn)5次,陽性對照及候選序列20號均出現(xiàn)3次,候選序列9號出現(xiàn)2次,其余均出現(xiàn)1次。之后利用流式細胞術(shù)對候選序列22號、候選序列9號及陽性對照進行初步親和力測定,結(jié)果顯示候選序列22號親和力為0.72 nM,候選序

12、列9號親和力為1.72 nM,陽性親和力為0.76 nM。同時,在轉(zhuǎn)染后60 h,對候選ErbB3 ScFv與細胞系A549中與細胞內(nèi)源表達的ErbB3進行激光共聚焦共定位實驗,結(jié)果顯示細胞內(nèi)源表達的ErbB3在細胞核、細胞質(zhì)及細胞膜上均存在,外源蛋白ErbB3 ScFv主要定位與細胞膜,與預期展示效果一致。
　　綜上所述,本研究成功構(gòu)建具有一定庫容量、多樣性及有效性的真核哺乳動物細胞展示型人源ScFv抗體庫,并基于該抗體庫成功篩