一種新的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文一種新的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建姓名：王曉蓉申請學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：沈(王羽)(王非)2000.6.1目前常用的基因表達(dá)系統(tǒng)多為病毒、細(xì)菌或酵母類表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)在于表達(dá)效率高，如原核表達(dá)系統(tǒng)中目的基因的蛋白表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的3050％。但此類表達(dá)系統(tǒng)對真核基因尤其是哺乳動(dòng)物的基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)，往往不能進(jìn)行正確的翻譯后加工，因而大大降低了基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞的外源基因表達(dá)

2、系統(tǒng)的表達(dá)效率通常很低，其中一個(gè)關(guān)鍵問題在于缺乏一種高效的表達(dá)載體。另一方面，現(xiàn)有的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因表達(dá)載體，多采用病毒性的啟動(dòng)子，如CMV、SV40啟動(dòng)子，病毒性啟動(dòng)子的應(yīng)用有其局限性，例如，在基因治療中，病毒性載體的成分有可能與體內(nèi)基因發(fā)生重組，因而可能導(dǎo)致遺傳性的突變或存在潛在的致病性。因此，有必要發(fā)展一種高效、安全而且適用范圍較廣的的真核基因表達(dá)載體，提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的效率。熱休克蛋白是一類進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)，它們

3、以分子伴侶的形式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生理功能，并參與細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)和應(yīng)答過程。本組以往的研究證實(shí)，hsp9013基因的5’上游區(qū)，第一外顯子和第一內(nèi)含子的片段可以介導(dǎo)報(bào)告基因在T淋巴細(xì)胞中的高組成性表達(dá)，并能被熱激和絲裂原誘導(dǎo)。經(jīng)過優(yōu)化重組，篩選出具有高效表達(dá)活性的重組調(diào)控序列，其轉(zhuǎn)錄活性高于CMV、RSV及SV40啟動(dòng)子。以此作為啟動(dòng)子，構(gòu)建了高效表達(dá)重組質(zhì)粒P61。但上述人源性高效表達(dá)重組啟動(dòng)子質(zhì)粒P61的其它一些元件仍是病毒性，本論文就是

4、在此基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行改建，刪除載體中病毒成分，代之以人類基因中的有效元件，構(gòu)建成高效表達(dá)載體pPS61：1、目的片段的擴(kuò)增與克隆從Jurkat細(xì)胞中提取基因組DNA，確定擴(kuò)增序列，設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法從基因組DNA中擴(kuò)增出目的片段，將其克隆到Tvector，成為過渡質(zhì)粒T600。2、人源性啟動(dòng)子的高效表達(dá)質(zhì)粒P61的改建對本組構(gòu)建的含人源性高效表達(dá)啟動(dòng)子的質(zhì)粒P61進(jìn)行改建，刪去原質(zhì)粒中用于檢測啟動(dòng)子活性的氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT