聚乳酸—己內(nèi)酯乳液靜電紡組織工程支架的制備及性能評(píng)價(jià).pdf

1、靜電紡絲技術(shù)利用靜電場(chǎng)力來形成超細(xì)纖維，是目前制備納米纖維最為便捷的技術(shù)之一。納米纖維比表面積大，可以形成多孔的纖維支架，并且可以由多種具有良好生物相容性的高聚物制得，這使得納米纖維在很多方面有得天獨(dú)厚的應(yīng)用。在作為組織工程支架方面，靜電紡超細(xì)纖維也顯示出其優(yōu)勢(shì)。在形態(tài)上，靜電紡纖維支架可以極大程度地模擬細(xì)胞外間質(zhì)，為細(xì)胞的粘附、增殖及分化提供了必要條件;在功能上，靜電紡纖維支架可以作為藥物儲(chǔ)存和釋放的載體。但是，常規(guī)的靜電紡絲方法在作

2、為藥物載體方面具有其局限性。大多數(shù)的靜電紡絲方法采用將藥物和紡絲溶液混溶的方法將藥物包覆在超細(xì)纖維內(nèi)，這將導(dǎo)致兩種不良后果:(1)如果藥物與紡絲溶液的親疏水性能相反（例如，親水的蛋白藥物與疏水的聚乳酸高聚物溶液）的話，就會(huì)形成不均勻的藥物溶液，導(dǎo)致藥物在纖維內(nèi)的不均勻分布，不利于藥物釋放的控制;(2)對(duì)于一些具有生物活性的藥物（例如生長因子），簡(jiǎn)單地將其與高聚物溶液混合很容易導(dǎo)致藥物失活或者聚集，這樣的藥物釋放至患處，不僅發(fā)揮不到積極的

3、治療作用，而且還有可能被身體識(shí)別為異體而發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，對(duì)患者非常有害。
　　針對(duì)上述問題，課題采取了乳液靜電紡方法來制備組織工程支架，研究工作分為三個(gè)部分:
　　(1)乳液靜電紡絲系統(tǒng)的建立
　　將模型蛋白藥物牛血清白蛋白(BSA)溶解于水溶液中，有機(jī)高聚物聚乳酸-己內(nèi)酯(PLCL)溶解于有機(jī)溶劑氯仿中，將兩相溶液制備成為均勻的乳液作為紡絲液。通過共聚焦顯微鏡(LSCM)對(duì)包覆有熒光物質(zhì)納米纖維的觀察，證實(shí)了所制得

4、的纖維為皮芯結(jié)構(gòu)。通過測(cè)定纖維支架的水接觸角來評(píng)定其親水性能，常規(guī)靜電紡PLCL纖維與乳液靜電紡PLCL_BSA纖維的水接觸角分別為135.10°和89.30°，這表明乳液靜電紡絲纖維的親水性能得到了明顯的提高，這對(duì)后期細(xì)胞的吸附以及細(xì)胞行為都是有利的。藥物BSA的體外釋放結(jié)果表明，在長達(dá)28天的釋放實(shí)驗(yàn)中，只有47.71％的BSA被釋放出來，該結(jié)果表明，所制備的乳液靜電紡載藥纖維能有效地抑制藥物的突釋現(xiàn)象，達(dá)到了長期釋放的效果。細(xì)胞增

5、殖實(shí)驗(yàn)表明，在7、14和21天，與PLCL纖維支架相比，PLCL_BSA上的細(xì)胞增殖分別高出41.8％、85.0％和49.7％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了乳液靜電紡纖維具有較好的生物相容性，與常規(guī)靜電紡方法所制備的纖維支架相比更加有利于支持細(xì)胞的貼附和增殖。
　　(2)擔(dān)載單藥物生長因子的乳液靜電紡納米纖維支架的制備及性能表征
　　利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)取代第

6、一部分工作中的模型蛋白藥物牛血清白蛋白(BSA)，并進(jìn)行紡絲實(shí)驗(yàn)，對(duì)所制備的纖維支架中纖維的皮芯結(jié)構(gòu)、親水性能、拉伸性能等進(jìn)行表征，并且通過細(xì)胞增殖MTS實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證包覆有VEGF的靜電紡絲支架的生物相容性。VEGF的釋放試驗(yàn)分為兩組，一組為利用葡聚糖（Dextran）水溶液作為VEGF的保護(hù)劑，記作PLCL-VEGF-DEX;另一組利用BSA水溶液作為保護(hù)劑，記作PLCL-VEGF-BSA。兩組均收到了良好的釋放效果，極大地抑制了初始突釋

7、現(xiàn)象。但是保護(hù)劑葡聚糖和牛血清白蛋白的選用會(huì)明顯地影響初始24小時(shí)內(nèi)藥物的釋放，其釋放量分別為1.0％和9.6％;在之后的640小時(shí)，二者間的區(qū)別不明顯，分別為11.6％和11.7％。細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)MTS結(jié)果說明，同純PLCL支架（常規(guī)靜電紡纖維支架）相比，含有VEGF的支架極大促進(jìn)了增殖效果，在細(xì)胞培養(yǎng)第10天和第20天時(shí)，相比于純PLCL纖維支架，PLCL-VEGF-BSA纖維支架上的細(xì)胞增殖分別高出32.3％和49.9％;PLCL-

8、VEGF-DEX纖維支架上細(xì)胞增殖分別高出14.6％和39.8％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)也表明，經(jīng)過靜電紡溶液配制和紡絲加工后，VEGF依然保持有明顯的活性。
　　為了進(jìn)一步提高纖維支架的生物相容性，提高對(duì)VEGF的保護(hù)及擔(dān)載效果，在皮芯結(jié)構(gòu)的纖維的芯層采用了天然高聚物明膠(Gelatin)來擔(dān)載VEGF，記作PLCL/GV。為了考察該纖維支架在支持間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化上所起的作用，通過5-氮胞苷(5-AZA)處理的方法在此纖維支

9、架上進(jìn)行了誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)。在第10天、第15天與第20天時(shí)，PLCL/GV纖維上的細(xì)胞增殖情況與純PLCL支架相比，分別高出35.5％，61.1％和73.4％。從細(xì)胞增殖情況來看，5-氮胞苷處理對(duì)纖維支架上細(xì)胞的增殖情況沒有顯著影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:由于VEGF的抗細(xì)胞凋零作用，PLCL/GV纖維支架可以有效減少由于5-氮胞苷帶來的細(xì)胞凋零，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了擔(dān)載在纖維芯層的VEGF具有良好的生物活性。纖維支

10、架上的細(xì)胞形態(tài)通過5-氯熒光雙乙酸鈉染色(CMFDA)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)。可以看出，細(xì)胞尺寸變大，并且呈現(xiàn)出多邊形形態(tài)，并且與臨近的細(xì)胞互相接觸。生長在PLCL/GV支架上的細(xì)胞與生長在純PLCL支架上的細(xì)胞從數(shù)量到形態(tài)都有明顯區(qū)別。PLCL/GV納米纖維上的細(xì)胞更多地呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞表型，這些細(xì)胞尺寸變大，形狀有所改變，彼此之間接觸并且形成了網(wǎng)絡(luò)。未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)細(xì)長，彼此平行，類似于成纖維細(xì)胞形狀。肌動(dòng)蛋白和重鏈肌球蛋白兩次染色實(shí)驗(yàn)均

11、說明PLCL/GV上的細(xì)胞表達(dá)出了更多的心臟特異性蛋白。
　　(3)擔(dān)載雙因子的乳液靜電紡納米纖維的制備及性能表征
　　利用乳液靜電紡纖維的皮芯結(jié)構(gòu)特性，制備了皮層擔(dān)載有羥基磷灰石(HA)、芯層擔(dān)載有層黏連蛋白(Laminin)的乳液靜電紡纖維支架，記作PLCL/HA/Lam，并且在纖維支架上進(jìn)行了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)。MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，從第7天開始，靜電紡纖維支架上細(xì)胞的增殖情況優(yōu)于組織培養(yǎng)板(TCP)。從第7天到第21天

12、，PLCL/HA/Lam纖維支架上的細(xì)胞增殖情況優(yōu)于其它支架。譬如21天時(shí)，與TCP、PLCL/HA（皮層擔(dān)載羥基磷灰石的單藥物纖維支架）和PLCL/Lam（芯層擔(dān)載層黏連蛋白的單藥物支架）相比，分別高出23.3％、12.0％和10.4％。在第14天和第21天，PLCL/HA/Lam纖維支架上的堿性磷酸酶活性顯著高于PLCL/HA和PLCL/Lam纖維支架(p≤0.05)，這是由于羥基磷灰石和層粘連蛋白的協(xié)同作用效果。EDX給出的數(shù)據(jù)在